【摘要】：研究背景和目的： 熱休克蛋白70羰基末端反應蛋白(CHIP)是一個分子伴侶蛋白和含有U-盒子(U-box)的泛素E3連接酶,可促進多種蛋白底物被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解和清除,在心肌細胞損傷、細胞凋亡、腫瘤、熱應急等方面起著重要的作用。但是,CHIP在Ang Ⅱ誘導的心肌纖維化、凋亡和炎癥反應中的作用及機制尚不清楚。因此,本研究主要探討了CHIP在Ang Ⅱ誘導心肌重塑中的作用及機制。 方法： 用10周齡野生型小鼠(WT)和心臟特異性過表達CHIP的轉(zhuǎn)基因小鼠(CHIP-TG)各16只,隨機分為4組,每組8只：(1)生理鹽水(NS)+WT組；(2)NS+CHIP-TG組；(3) Ang Ⅱ+WT組；(4) Ang Ⅱ+CHIP-TG組。采用植入式微量緩釋泵給小鼠灌注NS和Ang Ⅱ (1500ng/kg/min),一周后用B超儀檢測動物的心臟功能；心臟組織切片進行HE、Masson染色,分別觀察不同組別心臟組織中炎性細胞浸潤和膠原沉積的情況；應用免疫組織化學染色檢測不同組別心臟中巨噬細胞(Mac2-陽性細胞)數(shù)量、單核細胞趨化因子(MCP-1)、血管細胞間粘附分子(ICAM-1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、膠原Ⅰ型(Collage Ⅰ)和轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)的表達水平。應用RT-PCR檢測不同處理組MCP-1、ICAM-1、 Collage Ⅰ、 TGF-β、白細胞介素-1β(IL-1β)及IL-6的表達水平。應用TUNEL染色方法觀察心肌細胞的凋亡情況。應用siRNA-GFP和siRNA-CHIP腺病毒感染原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞24小時,然后用Ang Ⅱ (100nM)處理6-24小時,應用RT-PCR及TUNEL染色方法檢測不同處理組炎癥因子(如MCP-1、ICAM-1、 IL-1β和IL-6)的表達水平及心肌細胞的凋亡情況。另外,原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞,用絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK) p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的抑制劑刺激0.5小時后再用Ang Ⅱ(100nM)處理6-24小時,分別用RT-PCR和TUNEL染色方法檢測IL-1β、IL-6和心肌細胞凋亡的情況。最后,用免疫印記(Western blot)法檢測心臟組織及原代培養(yǎng)心肌細胞中p38MAPK、JNK和NF-κB的表達水平。 結果： 1)在NS處理時,WT和CHIP-TG組心臟功能、病理改變和炎性細胞浸潤情況均無明顯差別。 2) Ang Ⅱ處理7天后,與NS+WT組相比,Ang Ⅱ+WT組的心臟功能、纖維化面積、細胞凋亡情況和炎性細胞的浸潤程度均明顯增加。 3)與Ang Ⅱ+WT組相比,Ang Ⅱ+CHIP-TG組小鼠心臟組織中纖維化面積(Masson染色),α-SMA.Collage Ⅰ和TGF-β表達水平(α-SMA、Collage Ⅰ、 TGF-p免疫組化染色)明顯減少；心臟組織中巨噬胞浸潤(Mac-2染色)及炎癥因子表達水平(MCP-1, ICAM-1IL-1β和IL-6)均明顯減少；心肌細胞的凋亡情況(TUNEL)減輕。 4)原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞經(jīng)Ang Ⅱ處理后顯示,與siRNA-GFP對照組相比,siRNA-CHIP感染后可明顯上調(diào)炎癥因子(如MCP-1、ICAM-1、IL-1β和IL-6)的表達及增加心肌細胞的凋亡數(shù)量。 5) CHIP對Ang Ⅱ引起心肌重塑的保護作用是通過抑制p38MAPK.JNK及NF-κB信號通路的活性而實現(xiàn)的。 結論： CHIP通過抑制p38MAPK、JNK及NF-κB信號通路的激活,抑制Ang Ⅱ引起的心肌纖維化、細胞凋亡和炎癥反應。
[Abstract]:Research background and purpose:
The heat shock protein 70 carbonyl terminal reaction protein (CHIP) is a molecular chaperone protein and a ubiquitin E3 ligase containing the U- box (U-box). It can promote the degradation and removal of a variety of protein substrates by the ubiquitin proteasome system, and play an important role in myocardial cell damage, apoptosis, tumor, heat emergency and so on. But CHIP is induced by Ang II. The role and mechanism of myocardial fibrosis, apoptosis and inflammatory response are not clear. Therefore, this study mainly discusses the role and mechanism of CHIP in the remodeling of myocardium induced by Ang II.
Method:
10 weeks old wild type mice (WT) and 16 transgenic mice (CHIP-TG) with heart specific overexpression of CHIP were randomly divided into 4 groups, 8 rats in each group: (1) physiological saline (NS) +WT group; (2) NS+CHIP-TG group; (3) Ang II +WT group; (4) Ang II +CHIP-TG group. The cardiac function of animals was detected by B ultrasound, and HE and Masson staining of cardiac tissue sections were used to observe the infiltration of inflammatory cells and collagen deposition in different groups of cardiac tissues, and the number of macrophages (Mac2- positive cells), monocyte chemoattractant factor (MCP-1) and blood in different groups of hearts were detected by immunohistochemical staining. The expression level of intercellular adhesion molecule (ICAM-1), alpha smooth muscle actin (alpha -SMA), collagen type I (Collage I) and transforming growth factor beta (TGF- beta). The expression of MCP-1, ICAM-1, Collage I, TGF- beta, interleukin -1 beta (IL-1 beta) and IL-6) in different treatment groups was detected by RT-PCR. SiRNA-GFP and siRNA-CHIP adenovirus infected the primary cultured neonatal rat cardiomyocytes for 24 hours, and then treated with Ang II (100nM) for 6-24 hours. The expression level of inflammatory factors (such as MCP-1, ICAM-1, IL-1 beta and IL-6) in different treatment groups and the apoptosis of cardiac myocytes were detected by RT-PCR and TUNEL staining. Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes were stimulated with mitogen activated protein kinase (MAPK) p38, c-Jun amino terminal kinase (JNK) inhibitor for 0.5 hours and then treated with Ang II (100nM) for 6-24 hours. RT-PCR and TUNEL staining methods were used to detect the apoptosis of IL-1 beta, IL-6 and cardiac myocytes. Finally, the immunoimprint (Western blot) method was used. The expression levels of p38 MAPK, JNK and NF-kappa B in cardiac tissue and primary cultured cardiomyocytes were detected.
Result:
1) There was no significant difference in cardiac function, pathological changes and inflammatory cell infiltration between WT and CHIP-TG groups during NS treatment.
2) after 7 days of Ang II treatment, compared with the NS+WT group, the cardiac function, the area of fibrosis, the cell apoptosis and the infiltration degree of inflammatory cells in the group Ang II +WT were significantly increased.
3) compared with the Ang II +WT group, the area of fibrosis in the Ang II +CHIP-TG group (Masson staining), the level of the expression of alpha -SMA.Collage I and TGF- beta (alpha -SMA, Collage I, TGF-p immunohistochemical staining) were significantly reduced, and the expression of macrophage infiltration (Mac-2 staining) and inflammatory factors in the cardiac tissue (MCP-1, beta and +CHIP-TG) were all clear The apoptosis of cardiomyocytes (TUNEL) was reduced.
4) the primary cultured neonatal rat cardiomyocytes were treated with Ang II. Compared with the siRNA-GFP control group, siRNA-CHIP infection could obviously increase the expression of inflammatory factors (such as MCP-1, ICAM-1, IL-1 beta and IL-6) and increase the number of apoptosis in cardiac myocytes.
5) The protective effect of CHIP on Ang II-induced myocardial remodeling is achieved by inhibiting the activity of p38MAPK.JNK and NF-kappa B signaling pathways.
Conclusion:
CHIP inhibits myocardial fibrosis, apoptosis and inflammation induced by Ang II by inhibiting the activation of p38 MAPK, JNK and NF-kappa B signaling pathways.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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