發(fā)布時間：2018-08-06 16:44

【摘要】：頂器門原蟲可引起一些在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)方面危害非常嚴(yán)重的疾病。這些寄生蟲利用一些相似的亞細胞結(jié)構(gòu)、細胞器和相關(guān)分子侵入宿主細胞。含有1個或多個重復(fù)的TSP1結(jié)構(gòu)域的TRAP家族蛋白在蟲體的侵入和運動過程中發(fā)揮重要作用。目前已在各種瘧原蟲、柔嫩艾美爾球蟲、巨型艾美爾球蟲、弓形蟲、隱孢子蟲中發(fā)現(xiàn)了該蛋白家族的成員。這些蛋白質(zhì)大都定位于蟲體頭部的微線體上。目前已發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲的TRAP蛋白和弓形蟲的MIC2蛋白是蟲體侵入過程中的重要分子。 通過對微小隱孢子蟲的全基因組比對分析，發(fā)現(xiàn)有12個含有TSP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)編碼基因，但目前僅發(fā)現(xiàn)其中2個（TRAP-C1和TSP8）定位在蟲體的頂端微線體，其它的蛋白質(zhì)的定位及功能尚不清楚。本研究通過制備針對TSP3的單克隆抗體來定位該蛋白質(zhì)，為深入研究該蛋白質(zhì)的功能奠定基礎(chǔ)。 本研究首先對隱孢子蟲TSP家族蛋白TSP3蛋白質(zhì)的編碼基因的結(jié)構(gòu)進行分析，，發(fā)現(xiàn)其含有一個信號肽和跨膜區(qū)，其胞外區(qū)含有4個TSP1結(jié)構(gòu)域和2個apple結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其與已確定的隱孢子蟲微線體蛋白TRAP-C1在結(jié)構(gòu)上相似。分別設(shè)計2對PCR引物將其胞外區(qū)編碼基因分為兩段，其中第1段含有2個apple結(jié)構(gòu)域和1個TSP1結(jié)構(gòu)域，第2段含有3個串聯(lián)重復(fù)的TSP1結(jié)構(gòu)域。將擴增產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體，測序正確后克隆到pGEX-4T-1表達載體，在BL21中誘導(dǎo)表達，然后用谷胱甘肽磁珠純化。獲得了分段表達的TSP3重組蛋白TSP3-1和TSP3-2。 將純化后的重組蛋白質(zhì)腹腔免疫BALB/C小鼠獲得脾細胞，與Sp2/0細胞融合，成功獲得了雜交瘤細胞，經(jīng)過篩選、克隆后成功獲得了2株強陽性的雜交瘤細胞株，進一步成功獲得了抗TSP3的單克隆抗體，亞類鑒定結(jié)果表明所獲得的單克隆抗體均為IgG1亞型，通過間接免疫熒光法對該TSP3蛋白質(zhì)進行子孢子定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)位于子孢子的頭部，由于與侵入相關(guān)的蛋白質(zhì)均存在位于蟲體的頭部頂器部位，因此推測TSP3可能與蟲體的侵入功能相關(guān)，很可能是隱孢子蟲的另一個微線體蛋白。
[Abstract]:Protozoa can cause some very serious diseases in medicine and veterinary medicine. These parasites use similar subcellular structures, organelles and related molecules to invade host cells. TRAP family proteins containing one or more repeated TSP1 domains play an important role in the invasion and movement of the insect. At present, members of the protein family have been found in various Plasmodium, Eimeria tenella, giant Eimeria, Toxoplasma gondii and Cryptosporidium. Most of these proteins are located in the microsomes of the head of the worm. The TRAP protein of Plasmodium falciparum and the MIC2 protein of Toxoplasma gondii have been found to be important molecules in the process of body invasion. By analyzing the whole genome of Cryptosporidium minimus, we found that there are 12 protein coding genes containing TSP domain, but only 2 (TRAP-C1 and TSP8) are located at the top of the microline of Cryptosporidium microphylla, but only two of them (TRAP-C1 and TSP8) are located at the top of the parasite. The location and function of other proteins are unclear. In this study, monoclonal antibodies against TSP3 were prepared to locate the protein, which laid a foundation for further study of the function of the protein. In this study, the structure of the coding gene of TSP3 protein of Cryptosporidium TSP family was analyzed. It was found that it contained a signal peptide and a transmembrane region, and its extracellular domain contained four TSP1 domains and two apple domains. It was found that its structure was similar to that of the identified Cryptosporidium microline protein TRAP-C1. Two pairs of PCR primers were designed to divide the gene encoding extracellular domain into two segments, the first one containing two apple domains and one TSP1 domain, and the second one containing three tandem repeat TSP1 domains. The amplified product was cloned into pMD-18T vector, sequenced correctly, cloned into pGEX-4T-1 expression vector, induced in BL21, then purified by glutathione magnetic beads. TSP3 recombinant proteins TSP3-1 and TSP3-2 were obtained. After the purified recombinant protein was immunized intraperitoneally with BALB/C mice to obtain spleen cells and fused with Sp2/0 cells, hybridoma cells were successfully obtained. After screening, two strongly positive hybridoma cell lines were obtained. Furthermore, monoclonal antibodies against TSP3 were successfully obtained. The results of subclass identification showed that the obtained monoclonal antibodies were all IgG1 subtypes. The TSP3 protein was located by indirect immunofluorescence assay. It was found that the protein was located at the head of the sporozoite, and that the invasion-related proteins were located in the acrosome of the head of the parasite. Therefore, it was speculated that TSP3 might be related to the invading function of the parasite and might be another microline protein of Cryptosporidium.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：2168338