【摘要】：人食管下括約肌(Lower esophageal sphincter, LES)是位于食管胃結合部（Esophageogastric junction, EGJ）約2-3cm寬的特殊增厚環(huán)形肌。一般認為人LES是由胃小彎側的半環(huán)形鉤狀纖維和大彎側的斜行套索纖維所構成的。這兩束肌纖維與膈肌腳一起，在LES肌源性和神經源性的因素作用下保持持續(xù)性收縮的狀態(tài)，最終在EGJ形成高壓帶，從而防止胃內容物反流入食管；而另一方面，當發(fā)生吞咽和食管擴張時，在迷走神經的抑制性通路的作用下可以引起一過性的LES舒張（Transient lower oesophagealsphincter relaxation, TLESR），TLESR的存在，允許了食物繼續(xù)下行入胃，或形成嘔吐、打嗝，從而使胃內的液體或氣體反流進入食管。 LES的收縮和舒張的功能調節(jié)機制是在中樞神經系統(tǒng)的支配下，由多種激素、神經遞質及自身肌源性因素共同參與完成的。一般認為迷走神經輸出神經末梢與LES肌層腸道運動神經元（Enteric Motor Neurons, EMN）形成突觸聯系，共同構成了調節(jié)LES收縮和舒張的興奮性迷走神經通路和抑制性迷走神經通路。興奮性迷走神經通路由節(jié)前膽堿能神經元和節(jié)后膽堿能神經元共同構成。該通路的激活可以引起LES收縮。而抑制性迷走神經通路則是由節(jié)前膽堿能神經元和節(jié)后非腎上腺非膽堿能（NonadrenergicNoncholinergic, NANC）神經元構成。激活抑制性通路可以引起LES舒張。 多巴胺（Dopamine, DA）是兒茶酚胺類神經遞質之一，在自主運動、認知、情感、激素調節(jié)以及胃腸運動等功能的調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。這些功能的調節(jié)均是通過多巴胺受體（Dopamine receptor, DAR）實現的。DAR作為含有七跨膜結構域G蛋白偶聯受體家族重要的受體類型之一，廣泛存在于哺乳動物的中樞及外周神經系統(tǒng)。到目前為止已經發(fā)現DAR共有D1R-D5R五種亞型，按照各自的結構，藥理學性質以及生物學屬性可以將這些受體亞型分為D1樣受體（D1R、D5R）和D2樣受體（D2R、D3R、D4R）。近些年的研究表明，DAR廣泛地分布于動物的胃腸道之中。 多種食管運動功能異常性疾病如賁門失弛緩、彌漫性食管痙攣、胡桃夾食管等均與LES的運動異常有關，目前研究表明LES的調節(jié)機制涉及多種受體，神經遞質和信號轉導通路。研究表明膽囊收縮素受體（Cholecystokinin receptor），毒蕈堿受體（Muscarinic receptor）均在LES的調節(jié)機制中發(fā)揮著重要的作用。 本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，蛋白印跡法（Western-blot），離體肌張力測定技術以及電場刺激（Electrical fieldstimulation, EFS）等方法對DAR在人LES中的表達及功能進行研究。探討了DAR在人LES調節(jié)機制中的作用，為進一步研究DA及其受體在人LES調節(jié)機制中的作用奠定基礎，從而更為完善的闡述人LES調節(jié)機制，為食管運動功能障礙性疾病的臨床治療提供理論依據。 第一部分多巴胺受體在人食管下括約肌的表達研究目的：DAR是G蛋白偶聯受體家族重要的受體類型之一，介導著兒茶酚胺類神經遞質DA所有的生理學功能。本試驗采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白印跡法（Western-blot）研究人LES的DAR的5種亞型在鉤狀纖維、套索纖維、食管和胃底的環(huán)行肌中mRNA、受體蛋白的表達規(guī)律，探討DAR在人LES的功能調節(jié)中發(fā)揮的作用。 方法：選取2007年12月至2008年10月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院因高位食管中段癌，而行食管大部切除術的患者共30例。其中23名男性，7名女性，平均年齡64歲。手術室收集新鮮EGJ手術標本，實驗室銳性剝去食管下段、賁門及胃底的粘膜及粘膜下層后，制備鉤狀纖維、套索纖維、食管和胃底環(huán)行肌的肌條。提取組織RNA，經紫外分光光度計和1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度和完整性之后，分別應用5種DAR亞型的引物行RT-PCR，檢測其mRNA在4種肌條的表達，用Gel Pro軟件分析擴增產物的光密度值(IOD)，并計算DAR亞型與β-actin IOD的比值表示肌條中mRNA的相對含量。提取組織蛋白，經考馬斯亮藍G-250定量，將蛋白調整至相同濃度。然后應用電泳儀電泳，，分離出與DAR各個亞型相應的受體蛋白后轉膜，轉膜結束后分別應用DAR各個亞型的抗體進行孵育及DAB染色，經Gel Pro軟件分析DAB反應條帶的光密度值(IOD)。 結果：紫外分光度計測定顯示，總RNAA260/A280比值為1.6-1.8；1%瓊脂糖凝膠電泳可見28S條帶的寬度和亮度均是18S條帶的兩倍。內參β-actin于838bp處亮度均勻，在各個反應中，內參β-actin的PCR擴增結果一致。3種DAR亞型的mRNA在四種肌條中均可見表達，分別是D_1R，D_2R，D_5R。D_3R，D_4R的mRNA在四種肌條內均未見表達。PCR擴增產物的長度與其設計長度完全一致。同一肌條不同DAR亞型的mRNA表達水平的比較有統(tǒng)計學差異(F=669.00, P=0.00)，其表達水平的強度依次為：D1R＞D5R＞D2R。同一DAR亞型的mRNA表達水平在不同的肌條間的比較沒有統(tǒng)計學差異(F=0.18, P=0.90)。有3種DAR的受體亞型的蛋白在四種肌條內均可見表達，分別是D1R，D2R，D5R，其分子量大小依次為51KD、51KD、53KD。D3R，D4R的蛋白在四種肌條內均未見表達。同一肌條不同DAR亞型的蛋白表達水平的比較有統(tǒng)計學差異(F=84.53, P=0.00)，其蛋白表達水平的強弱與mRNA表達水平的結果一致。同一DAR亞型的蛋白表達水平在不同的肌條間比較沒有統(tǒng)計學差異(F=0.10, P=0.96)。 結論：人LES存在3種DAR亞型，分別是D1R，D2R，D5R。其表達水平的高低依次為D1RD5R D2R，可能在LES的功能調節(jié)中發(fā)揮著作用。D3R和D4R在人LES中無表達，可能對LES的功能調節(jié)沒有影響。 第二部分多巴胺受體在人食管下括約肌調節(jié)機制中的功能研究 目的：研究非選擇性DAR的激動劑和拮抗劑以及選擇性的DAR的激動劑對人離體LES的鉤狀纖維（clasp）、套索纖維（sling）的作用，探討DAR在人LES收縮和舒張的調節(jié)機制中所發(fā)揮的的作用。 方法：選取2010年8月到2011年3月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院因高位食管中段癌行食管大部切除術患者30例。男性患者17例，女性患者13例，平均年齡62歲。手術室采集新鮮標本，于標記處沿胃大彎側切開標本，粘膜面向上固定于盛有Krebs液的蠟盤中，持續(xù)通以95％O2和5％CO_2的混合氣體。銳性剝離胃賁門部以及食管下段的粘膜層及粘膜下層，可見食管胃結合部的發(fā)白增厚的肌肉環(huán)，即為LES。肉眼識別出胃小彎側位于標本的中央呈半環(huán)形的鉤狀纖維（clasp）與胃大彎側位于標本的兩端并呈斜行的套索纖維（sling）。沿著各自肌纖維走行的方向銳性游離鉤狀纖維（clasp）和套索纖維（sling），制備2mm×10mm的肌條。應用絲線分別將肌條的兩端扎緊，置于含Krebs液10ml的浴槽中，保持37℃恒溫條件。持續(xù)通以95%O2和5%CO2的混合氣體。肌條下端固定，上端固定于JZ101型肌肉張力換能器，經Medlab信號采集系統(tǒng)記錄張力變化情況。輕微緩慢牽拉肌條使之張力維持于200mg，此時的肌條長度作為初始長度L0，然后多次緩慢牽拉肌條，每次增加其初始長度L0的25％左右，每次待被動張力穩(wěn)定15min后，再次牽拉。如此反復，每次牽拉間隔約20min，直至牽拉肌條長度至初始長度L0的200％為最適初長度。待肌條最適初長度穩(wěn)定約40分鐘后，以濃度累積方式向浴槽中加入非選擇性DAR激動劑（Dopamine hydrochloride, DA），給藥濃度為(10~(-9)、10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)、10~(-3)mol/L)。觀察給藥后肌條張力變化情況，待變化穩(wěn)定后可以增加一個濃度，繼續(xù)加藥，每次加藥前都要在前一濃度達到最大反應穩(wěn)定后再加入。每次加藥的間隔時間約為肌條平衡后10分鐘。然后建立累計給藥的濃度-反應量效曲線，計算出加藥后反應的最大效應及對應濃度。然后徹底沖洗肌條，待張力穩(wěn)定后向浴槽中加入非選擇性DAR拮抗劑（Flupenthixol dihydrochloride），加樣濃度與誘導肌條產生最大效應的激動劑濃度相對應。觀察其對DAR的拮抗作用。選擇性的D-1樣受體激動劑（(±)-SKF-3893），選擇性的D2R激動劑（(-)-Quinpirolehydrochloride）的加藥方法同前。藥物誘發(fā)的肌條反應均以肌條收縮或舒張百分比的均數±標準誤(x±SE)來表示。 結果： 1非選擇性DAR激動劑及拮抗劑對人LES的作用非選擇性DAR激動劑DA在（10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)、10~(-3)mol/L）的濃度可以誘導人LES的套索纖維、鉤狀纖維兩種肌條產生收縮效應，在（10~(-5)、10~(-4)、10~(-3)mol/L）的濃度，在收縮反應的同時還可以誘導人LES的套索纖維、鉤狀纖維兩種肌條產生舒張效應。應用非選擇性DAR的阻滯劑（Flupenthixol dihydrochloride）（10~(-4)mol/L）可以完全抑制DA（10~(-4)mol/L）所產生的套索纖維、鉤狀纖維的收縮、舒張效應。 2選擇性的D-1樣受體激動劑(±)-SKF-3893對人LES的作用選擇性的D-1樣受體激動劑(±)-SKF-3893在（10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)、10~(-3)mol/L）濃度下可以誘導人LES的套索纖維、鉤狀纖維兩種肌條產生濃度依賴性的收縮效應。兩肌條間收縮效應比較沒有統(tǒng)計學差異（F=0.401，P=0.808）。在10~(-4)mol/L時，兩肌條均達到最大收縮百分比。鉤狀纖維的最大收縮百分比為（15.8±2.2）％，套索纖維的最大收縮百分比為（17.8±2.1）％。兩者比較無統(tǒng)計學差異（F=0.015，P=0.903）。 3選擇性的D2R激動劑(-)-Quinpirole hydrochloride對人LES的作用 選擇性的D2R激動劑(-)-Quinpirole hydrochloride在（10~(-5)、10~(-4)、10~(-3)mol/L）濃度下可以誘導人LES的套索纖維、鉤狀纖維兩種肌條產生濃度依賴性的舒張效應，兩肌條間舒張效應比較沒有統(tǒng)計學差異（F=1.258，P=0.292）。在10~(-3)mol/L時，兩肌條均達到最大舒張百分比。鉤狀纖維的最大舒張百分比為（12.0±1.6）％，套索纖維的最大舒張百分比為（10.8±2.1）％，兩者比較無統(tǒng)計學差異（F=0.131，P=0.721）。 結論： 1非選擇性DAR激動劑DA低濃度時可以誘導人LES收縮效應，隨著其濃度的升高逐漸出現舒張效應。非選擇性DAR的阻滯劑Flupenthixoldihydrochloride可以完全抑制非選擇性激動劑所誘導的LES的收縮、舒張效應。表明非選擇性激動劑是通過DAR來實現其對LES的調節(jié)作用。 2選擇性的D-1樣受體激動劑(±)-SKF-3893可以誘導人LES的兩種肌條產生濃度依賴性的收縮效應。在10-4mol/L時，達到最大收縮百分比。兩肌條間收縮效應比較沒有統(tǒng)計學差異。提示D-1樣受體可能參與了LES調節(jié)過程中的收縮反應。 3選擇性的D2R激動劑(-)-Quinpirole hydrochloride可以誘導人LES的兩種肌條產生濃度依賴性的舒張效應，在10-3mol/L時，達到最大舒張百分比。兩肌條間舒張效應比較沒有統(tǒng)計學差異。提示D2R可能參與了LES調節(jié)過程中的舒張反應。 第三部分多巴胺受體在電刺激誘導人食管下括約肌反應中的作用研究 目的：研究選擇性DAR的拮抗劑在電場刺激下對人LES的鉤狀纖維、套索纖維的作用，探討DAR在LES神經調節(jié)通路中發(fā)揮的作用。 方法：選取2011年3至2011年11月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院因高位食管中段癌，行食管大部切除術患者20例，其中男性患者14例，女性患者6例，平均年齡58歲。制備鉤狀纖維和套索纖維肌條，方法同前。將肌條置于含10ml Krebs液的浴槽中，保持37℃恒溫條件。持續(xù)通以95%O2和5%CO_2的混合氣體。將肌條的下端固定于帶鉑金電極的L形的固定架上。上端與肌肉張力換能器固定，Medlab信號采集系統(tǒng)記錄肌條張力變化情況。確保肌條位于兩個呈環(huán)形且平行的鉑金電極中間，其上下端與電極環(huán)間的距離應當大于3mm，并將鉑金電極與生理藥理多用儀連接，準備實施電場刺激。調節(jié)肌條長度至最適初長度，方法同前。EFS刺激參數：單脈沖方波、波寬5ms、電壓50V、頻率1～512Hz以倍數遞增。頻率從小到大行EFS，計算刺激后的最大效應(E_(max))。刺激停止后待肌條恢復平衡，分別依次向浴槽加入選擇性的D-1樣受體拮抗劑SCH23390（10~(-4)mol/L）；選擇性的D_2R拮抗劑Spiperone hydrochloride（10~(-3)mol/L）。在加藥后20分鐘后再分別行EFS，比較加藥前后EFS刺激人LES出現的反應有無變化。EFS誘發(fā)的肌條反應均以肌條的收縮或舒張百分比的均數±標準誤(x±SE)來表示。 結果： 1電場刺激對LES鉤狀和套索纖維的作用：電場刺激可誘導鉤狀纖維出現頻率依賴性舒張，最大舒張時電刺激頻率為64Hz，當每一次刺激所引起的舒張反應結束后，肌條立即出現反跳性收縮，亦呈頻率依賴模式。EFS誘導鉤狀纖維舒張的最大舒張百分比為17.1±2.1％。套索纖維對EFS的反應表現為頻率依賴性的收縮反應，最大收縮時電刺激頻率為128Hz。EFS誘導套索纖維收縮的最大收縮百分比為13.6±1.8％。 2選擇性的D-1樣受體拮抗劑SCH23390和選擇性的D2R拮抗劑Spiperone hydrochloride在EFS引起的人LES鉤狀纖維頻率依賴性舒張反應中的作用：選擇性D-1樣受體拮抗劑（10~(-4)mol/L）對電場刺激引起的人LES鉤狀纖維頻率依賴性舒張反應無影響，比較用藥前后舒張效應無統(tǒng)計學差異（F=1.142，P=0.342）。選擇性的D_2R拮抗劑（10~(-3)mol/L）對頻率依賴性的舒張反應也無影響，比較用藥前后舒張效應無統(tǒng)計學差異（F=0.359，P=0.837）。 3選擇性的D-1樣受體拮抗劑SCH23390和選擇性的D_2R拮抗劑Spiperone hydrochloride在EFS引起的人LES套索纖維頻率依賴性收縮反應中的作用：選擇性D-1樣受體拮抗劑（10~(-4)mol/L）對電場刺激的引起人LES套索纖維頻率依賴性收縮反應無影響，比較用藥前后收縮效應無統(tǒng)計學差異（F=0.354，P=0.840）。選擇性的D_2R拮抗劑（10~(-3)mol/L）對頻率依賴性的收縮反應也無影響，比較用藥前后收縮效應無統(tǒng)計學差異（F=0.651，P=0.627）。 結論： 1電場刺激可以誘導鉤狀纖維出現頻率依賴性舒張反應。最大舒張時電刺激頻率為64Hz。電場刺激可以誘導套索纖維頻率依賴性的收縮反應，最大收縮時電刺激頻率為128Hz； 2分別應用選擇性D-1樣受體拮抗劑SCH23390和選擇性D_2R拮抗劑Spiperone hydrochloride后，比較用藥前后EFS所誘導人LES鉤狀纖維頻率依賴性舒張反應發(fā)現，用藥前后舒張反應的變化無統(tǒng)計學差異。提示在EFS所誘導的鉤狀纖維出現的頻率依賴性舒張反應中沒有D-1樣受體的參與。 3分別應用選擇性D-1樣受體拮抗劑SCH23390和選擇性D2R拮抗劑Spiperone hydrochloride后，比較用藥前后EFS所誘導人LES套索纖維頻率依賴性收縮反應發(fā)現，用藥前后收縮反應的變化無統(tǒng)計學差異。提示在EFS所誘導的套索纖維出現的頻率依賴性收縮反應中沒有D2R的參與。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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