【摘要】：漢賽巴爾通體是巴爾通體屬中重要的人獸共患病病原菌,具有廣泛的致病性,可累及全身各組織和器官。貓抓病是其主要致病種類,一般表現(xiàn)為良性自限性。但是一旦機(jī)體免疫功能降低,則可能發(fā)生嚴(yán)重的全身病癥,極個別還會導(dǎo)致死亡。研究認(rèn)為漢賽巴爾通體某些亞型的分布具有地理特異性,并與其所致疾病的種類和強(qiáng)度有關(guān),其他國家的研究者已將多種分子方法應(yīng)用于漢賽巴爾通體的亞型分析,而在中國,目前還沒有關(guān)于漢賽巴爾通體種類多樣性的報道,我們對該病原體在中國的基因型別差異、群體結(jié)構(gòu)特征和分布情況還缺乏了解,對國內(nèi)外同類分離株的差異還不清楚。為回答上述問題,本研究通過多位點序列分型(MLST)、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)和基因組單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析等方法,并結(jié)合實驗室前期的脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型數(shù)據(jù)對中國漢賽巴爾通體作了全面的分子分型分析。 應(yīng)用MLST方法將近幾年實驗室保藏的80株漢賽巴爾通體分為3個序列型(ST),其中ST1占分離株總數(shù)的90%(72/80),ST9和ST30分別占8.25%(7/80)和1.25%(1/80)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,3個序列型來自一個克隆群,一方面提示中國漢賽巴爾通體由高度克隆化的菌株進(jìn)化演變而來,并隨著時間的變遷,積累一些散在變異；另一方面,提示目前的MLST方案不適合于中國漢賽巴爾通體菌的流行情況調(diào)查,廣泛存在的ST1菌株間的變異需要分辨能力更強(qiáng)的方法來發(fā)現(xiàn)。 同時,我們在實驗室建立了分辨力更高的MLVA方法,用以比較中國和英國漢賽巴爾通體分離株的基因型別差異。在選用的6個VNTR位點中,各自的分辨力Nei's指數(shù)在0.54～0.90間,位點聯(lián)合之后將84株菌分為53種不同的MLVA型(MT),總的分辨力指數(shù)達(dá)到0.98。聚類分析顯示該MLVA方法能將參與分析的菌株分為Group A和Group B兩個類群,其中Group A包含的7株菌全部來自英國,余下所有菌株屬于Group B。Group B又可被分為Group B1和Group B2兩個業(yè)群及B2中的5個小類。不同的業(yè)群和小類表現(xiàn)出菌株不同的地理分布特征。最小生成樹圖將參與分析的62株ST1漢賽巴爾通體分為6個類群,提示ST1菌株內(nèi)部的復(fù)雜多樣性。7株ST9細(xì)菌也有1株分到ST1所在類群中,反映出菌株可能的進(jìn)化演變途徑。 為進(jìn)一步了解ST1菌株間的變異情況,我們用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的SOLiD測序儀對分離自中國不同地點和時間的4株ST1細(xì)菌進(jìn)行重測序,做基因組水平的SNP分析,4株細(xì)菌的MT和PFGE結(jié)果也互不相同,同時參與分析比較的還有8株分離自英國的不同ST菌株。結(jié)果顯示,一共有9566個SNP位點分布于12個測序菌株,ST1的SNP數(shù)目范圍在374-1932間。基于SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹能將所有ST1菌株分開,顯示出基因組SNP分析的強(qiáng)大分辨力。同時發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象,中國的4株ST1細(xì)菌被分為2個分支,其中一株與作為參考菌株的ST1聚到一起,而其余3株自成一支。提示ST1內(nèi)部存在變異體,但變異有限,可能形成另一個亞克隆群,而當(dāng)前的MLST方案未能發(fā)現(xiàn)。 通過基因組SNP數(shù)據(jù)對MLST方案進(jìn)行改進(jìn),應(yīng)用于分離菌株,我們找出了隱藏于ST1中的亞型,使MLST結(jié)果與SNP分析一致。同其它兩種分型方法比較,發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后的MLST方案與MLVA聚類結(jié)果部分吻合,而完全對應(yīng)于PFGE分出的2大類群,綜合各方法的分型能力,推薦使用MLST與PFGE聯(lián)合使用的辦法調(diào)查漢賽巴爾通體的流行病學(xué)特征。同時,基因組測序數(shù)據(jù)提供了關(guān)于漢賽巴爾通體菌株內(nèi)部的基因表達(dá)和蛋白編碼方面的變異特征,還需要進(jìn)一步分析。
[Abstract]:Han Sabar general body is an important zoonosis pathogen of the genera of Barr. It has extensive pathogenicity and can involve all tissues and organs of the whole body. Cat scratch disease is the main pathogenic species and generally shows a benign self restriction. But once the immune function is reduced, it may cause serious systemic disease, and it may cause death in a few cases. It is considered that the distribution of some subtypes of Han Sabar's common body is geographically specific and is related to the species and intensity of the disease. Researchers in other countries have applied a variety of molecular methods to the subtype analysis of hhsbarall body. In China, there is no report on the variety of the species of the Han Sabar body. The differences in genotypes, population structure and distribution of pathogens in China are still lack of understanding, and the differences in the domestic and foreign isolates are not clear. To answer the above questions, this study has been analyzed by multipoint sequence typing (MLST), multipoint variable number tandem repeat sequence analysis (MLVA) and genomic single nucleotide polymorphism (SNP) analysis. Based on the data of the pulsed field gel electrophoresis (PFGE) in the laboratory, the molecular typing of Han Sabar's whole body in China was analyzed.
80 Han Sabar bodies preserved by the MLST method in recent years were divided into 3 sequence types (ST), of which ST1 accounted for 90% (72/80) of the total number of isolated strains, ST9 and ST30 accounted for 8.25% (7/80) and 1.25% (1/80). Phylogenetic analysis showed that 3 sequences came from a clon group. On the one hand, the Chinese Han Sabar body was highly cloned. The evolution of the strain evolved and accumulated some of the variation with time. On the other hand, the current MLST scheme was not suitable for the investigation of the epidemic situation of the Chinese Han Sabar. The widely existing ST1 strains need a more discernable method to find out.
At the same time, we have established a higher resolution MLVA method in the laboratory to compare the genotypic differences between Chinese and British Han Sabar isolates. In the 6 VNTR loci selected, the respective resolution Nei's index is 0.54 to 0.90, and the 84 strains are divided into 53 different MLVA types (MT) and the total resolution index after the combination of the loci. The 0.98. clustering analysis showed that the MLVA method could divide the analyzed strains into two groups of Group A and Group B, of which all the 7 strains of Group A were from the UK. The remaining strains belonged to Group B.Group B and could be divided into two industry groups and 5 small classes. The minimum spanning tree map was divided into 6 groups of the 62 ST1 strains of ST1, suggesting that 1 strains of the complex diversity of ST9 bacteria within the ST1 strain were divided into the group of ST1, reflecting the possible evolutionary evolutionary pathways of the strain.
In order to further understand the variation among ST1 strains, we re sequenced 4 ST1 strains isolated from different locations and times in China by using the Bio System Inc SOLiD sequencer, do genomic level SNP analysis, and the MT and PFGE results of 4 strains of bacteria are not the same. In the same time, 8 strains were isolated from the UK. The results showed that 9566 SNP loci were distributed in 12 sequenced strains, and the number of SNP in ST1 was 374-1932. The phylogenetic tree based on SNP could separate all ST1 strains and showed the strong resolution of genomic SNP analysis. At the same time, an interesting image was found, and 4 ST1 bacteria in China were divided into 2 branches. One strain was clustered with the ST1 as a reference strain, while the rest of the 3 strains became one. Suggesting the existence of a variant in ST1, but the variation is limited, and another subgroup may be formed, but the current MLST scheme has not been found.
Using genomic SNP data to improve the MLST scheme, we applied it to isolate the strains. We found the subtype hidden in the ST1, and made the MLST results consistent with the SNP analysis. Compared with the other two types, the improved MLST scheme was partly consistent with the MLVA clustering results, and the complete corresponding to the PFGE was divided into 2 groups and integrated the methods. It is recommended to use the method of MLST and PFGE to investigate the epidemiological characteristics of Han Sabar's common body. At the same time, genome sequencing data provide the variation characteristics of gene expression and protein coding in the genostrains of Han Sabar, and need to be further analyzed.
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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本文編號：2148162