【摘要】：炭疽致死毒素能夠殺傷特定來源的近交系小鼠的巨噬細(xì)胞。已知炭疽致死因子(LF)能夠特異性酶切MAPKKs的N端造成MAPK信號通路的紊亂并促使細(xì)胞內(nèi)炎性體的生成。目前尚不清楚LF如何使敏感的小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生快速裂解。 目前用于研究的LF的來源并不統(tǒng)一,包括天然提取的LF以及從Escherichia coli,Bacillus subtilis,B. anthracis等重組表達(dá)所得,各種方法獲得的LF活性差異較大,有時可相差3倍。LF在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其生理作用遵循蛋白質(zhì)N端規(guī)則,表明其N端的氨基酸序列對其穩(wěn)定性有顯著影響。為獲得具有完整N端的無標(biāo)簽重組LF,從炭疽芽孢桿菌減毒株A16R擴(kuò)增了LF基因,構(gòu)建了pAS22-LF質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入E.coli DH5?中,經(jīng)擴(kuò)增菌體,IPTG誘導(dǎo),高滲休克法裂解細(xì)胞壁釋放蛋白,再經(jīng)4步純化得到純度大于90%的LF蛋白。經(jīng)Western Blot檢測證明所表達(dá)蛋白為LF。經(jīng)過質(zhì)譜分子量測定所獲得LF分子量為90KD,與LF理論分子量一致。N端氨基酸序列測定結(jié)果顯示N端序列與天然LF N端序列一致。HPLC純度測定表明所獲得LF蛋白及其突變體LF E687A純度均大于90%。內(nèi)毒素用鱟試劑檢測原液為陰性,表明內(nèi)毒素含量低于0.5EU/ml。在細(xì)胞攻毒試驗中,純化LF的LC50小于1ng/ml。這一LF的標(biāo)準(zhǔn)化工作為下一步研究LF在細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 已知LF作用于Nalp1bS小鼠巨噬細(xì)胞能夠誘導(dǎo)細(xì)胞快速裂解,從LF進(jìn)入胞質(zhì)依次發(fā)生MEKs N端或其它分子的酶切、蛋白酶體切割未知蛋白、線粒體功能紊亂、K+外流、caspase-1炎性體的激活、細(xì)胞膜透化作用和細(xì)胞裂解并伴隨著IL-18和IL-1?的釋放。已知caspase抑制劑和蛋白酶體抑制劑可以保護(hù)細(xì)胞免受LT所帶來的細(xì)胞裂解,蛋白酶體抑制劑抑制caspase-1激活的上游事件而抑制caspase-1的激活。Caspase信號通路與蛋白酶體之間在小鼠巨噬細(xì)胞快速裂解這一現(xiàn)象中有什么聯(lián)系仍然知之甚少。蛋白酶體作用于什么蛋白而使caspase-1激活受到抑制對于研究LF對細(xì)胞的殺傷具有重大意義。我們選擇對LT敏感的J774A.1細(xì)胞作為研究對象,分別對LT攻擊過的J774A.1細(xì)胞的caspase-1,3/7等分子進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)LT誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞裂解前期caspase-1的活性在15分鐘時快速升高并一直維持至75分鐘左右,而caspase-3/7的活性和PA+LF E687A相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。而Annexin V和PI雙染色以及流式細(xì)胞儀檢測同樣發(fā)現(xiàn)沒有caspase-3/7的激活�？梢哉J(rèn)為,在LT誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞快速裂解的過程中,不需要caspase-3/7為中心的細(xì)胞凋亡通路的參與,而與caspase-1的激活有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)常用的抑制LF殺傷細(xì)胞的蛋白酶體抑制劑MG-132和lactacystin均能有效抑制NF-κB信號通路的激活。于是我們檢測NF-κB信號通路在受LF攻擊時各成員分子的變化。通過Western Blot及磷酸化水平的檢測,發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路在受LF攻擊時在很短時間內(nèi)被顯著激活。我們在細(xì)胞被LT攻擊后不同時間點加入NF-κB抑制劑,發(fā)現(xiàn)BAY11-7082 NF-κB抑制劑可以在LT作用前期給予細(xì)胞一定的保護(hù)效果。但其作用時間有限,30分鐘后對細(xì)胞保護(hù)效率大大降低。 受LT攻擊的J774A.1細(xì)胞的裂解是一個非常快速的過程,在細(xì)胞裂解前內(nèi)部發(fā)生了怎樣的變化導(dǎo)致了細(xì)胞不可避免的裂解,或者說為這一裂解做了哪些準(zhǔn)備是我們研究的目的之一。另外線粒體在LT攻擊中受損的情況與細(xì)胞的快速裂解密切相關(guān),而細(xì)胞核在細(xì)胞受損時是變化最晚的細(xì)胞器之一,這些細(xì)胞器在LT攻擊中的變化情況同樣值得研究。為了分析J774A.1細(xì)胞裂解前后蛋白質(zhì)水平的變化,我們在先前工作的基礎(chǔ)上對正常J774A.1細(xì)胞和受LT攻擊50%存活的J774A.1細(xì)胞分別進(jìn)行了親水/疏水膜蛋白、線粒體蛋白、細(xì)胞核蛋白的提取,并對每一組分進(jìn)行了雙向電泳分析。經(jīng)PDquest軟件分析,挑選分別上調(diào)或下調(diào)2倍的蛋白差異點進(jìn)行膠內(nèi)酶切,然后進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)檢測,共檢測出32個蛋白。這些蛋白包括細(xì)胞應(yīng)激類、細(xì)胞能量代謝類及細(xì)胞骨架類,反應(yīng)了細(xì)胞在受到LT攻擊后成熟細(xì)胞因子產(chǎn)生急劇增長、過氧化物產(chǎn)生增多、能量代謝障礙和細(xì)胞骨架受損。另外我們檢測到兩個蛋白與NF-κB信號通路有關(guān),一個是表達(dá)上調(diào)的valosin containing protein p97(VCP),一個是降低的high mobility group protein B1(HMGB1),前者能夠在細(xì)胞內(nèi)與IκB-α形成復(fù)合物促進(jìn)蛋白酶體對IκB-α的降解激活NF-κB通路。HMGB1是細(xì)胞核內(nèi)高度保守的非組DNA結(jié)合蛋白,是細(xì)胞的內(nèi)源性危險信號,當(dāng)細(xì)胞受到脅迫或壞死時,HMGB1釋放到胞外,通過單核巨噬細(xì)胞等表面高度糖基化作用終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)和TLR(Toll like receptor)活化了NF-κB的轉(zhuǎn)錄。 通過上述實驗結(jié)果,我們認(rèn)為LT攻擊小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1時NF-κB信號通路被激活,使細(xì)胞在短暫的時間內(nèi)受到caspase-1炎性體激活的炎性細(xì)胞因子作用,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)針對炎性反應(yīng)的對抗措施失效而導(dǎo)致胞內(nèi)溶酶體膜透化作用釋放組織蛋白酶最終使細(xì)胞裂解。
[Abstract]:It is known that the anthrax lethal factor ( LF ) can specifically cleave the N - terminus of MAPKKs to cause the disorder of MAPK signaling pathway and promote the formation of inflammatory cells in the cells . It is not clear how LF can rapidly lyse sensitive mouse macrophages .

LF was amplified from Bacillus anthracis attenuated strain A16R . The results showed that the purity of LF protein and its mutant LF E687A were more than 90 % . The results showed that the purity of LF protein and its mutant LF E687A were more than 90 % .

The activation of caspase - 1 and the activation of caspase - 1 and the activation of caspase - 1 were investigated by Western Blot and phosphorylation .

In order to analyze the changes of protein levels before and after the cell lysis , we detected 32 proteins . In order to analyze the changes of protein levels before and after cell lysis , we detected 32 proteins .

Through the above experimental results , we believe that the NF - 魏B signaling pathway is activated when LT attacks mouse macrophages J774A . 1 , which causes the cells to be activated by caspase - 1 inflammatory cytokines in a short period of time , which causes the intracellular lysosomal membrane permeabilization to release the tissue protease and eventually cause cell lysis .
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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本文編號：2135539