【摘要】：超低溫冷凍保存神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells, NSCs)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病和組織損傷等疾病的臨床治療具有十分重要的意義。 本文對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)進(jìn)行研究,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、臺(tái)盼藍(lán)染色法、Hochest/PI熒光雙重染色法及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。證明了所培養(yǎng)的細(xì)胞具有增殖能力等神經(jīng)干細(xì)胞的主要特性,保證了實(shí)驗(yàn)材料的生物活性,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的細(xì)胞來(lái)源。 通過(guò)滲透壓技術(shù)對(duì)冷凍保護(hù)劑(cryoprotective agent, CPA)的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。本文選取了兩種冷凍保護(hù)劑,考察了冷凍保護(hù)劑種類、濃度、細(xì)胞密度等因素對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,滲透壓法是一種既簡(jiǎn)潔又準(zhǔn)確的表征溶液中主要溶質(zhì)濃度的方法；冷凍保護(hù)劑在導(dǎo)入過(guò)程中造成的細(xì)胞損傷主要為滲透損傷和毒性損傷,受二者共同作用存在冷凍保護(hù)劑最佳導(dǎo)入時(shí)間和最優(yōu)導(dǎo)入方案。 采用顯微圖像采集分析的方法,以氯化鈉為神經(jīng)干細(xì)胞的非滲透性溶質(zhì),成功獲得懸浮神經(jīng)干細(xì)胞滲透不變體積比為0.391。最后,分別應(yīng)用K-K模型和經(jīng)典兩參數(shù)模型來(lái)表征CPA和水在神經(jīng)干細(xì)胞中一維輸運(yùn)的物理過(guò)程。確定保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)和乙二醇(EG)導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞時(shí)的三個(gè)滲透參數(shù)Lp(水的胞膜滲透率)、ω(保護(hù)劑的胞膜滲透率)、σ(反射系數(shù))值。結(jié)果分別為：K-K模型DMSO：Lp=0.172μm/minatm, co=8.980×10-2μm/s,σ=0.92; EG:Lp=0.198μm/min atm, co=7.880×10-2μm/s, a=0.90;2-P模型DMSO:Lp=0.168μm/min atm,ω=9.081×10-2μm/s; EG:Lp=0.174μm/min atm,ω=8.009×10-2μm/s。為進(jìn)一步優(yōu)化冷凍保護(hù)劑在神經(jīng)干細(xì)胞中的導(dǎo)入和洗脫方案提供參考。
[Abstract]:Cryopreservation of neural stem cells (NSCs) is of great significance for the clinical treatment of neurodegenerative diseases and tissue damage. In this paper, the in vitro culture of neural stem cells was studied. Cell morphology, trypan blue staining, Hochest-Pi fluorescence double staining and growth curve measurement were used. It is proved that the cultured cells have the main characteristics of neural stem cells such as proliferative ability, which ensures the biological activity of the experimental materials and provides sufficient cell sources for the subsequent experiments. The concentration of cryopreservation agent (cryoprotective agent, CPA was determined by osmotic pressure technique. In this paper, two kinds of cryopreservation agents were selected to investigate the effects of the types, concentrations and cell density of cryopreservation agents on neural stem cells (NSCs). The results show that osmotic pressure method is a simple and accurate method to characterize the concentration of major solutes in solution, and the cell damage caused by cryopreservation agent is mainly osmotic damage and toxic damage. The best import time and the optimal import scheme of the freezing protectant are existed. By means of microscopic image acquisition and analysis, using sodium chloride as the impermeable solute of neural stem cells, the immutable osmotic volume ratio of suspension neural stem cells was 0.391. Finally, K-K model and classical two-parameter model were used to characterize the one-dimensional transport of CPA and water in neural stem cells. The values of three permeable parameters L _ p (cell membrane permeability of water), 蠅 (cell membrane permeability of protection agent) and 蟽 (reflection coefficient) were determined when dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) were introduced into neural stem cells. The results were as follows: DMSOO: Lp1 0.172 渭 m / min atm, co=8.980 脳 10 -2 渭 m / s, 蟽 0.92; EGSO: LpX 0.198 渭 m/min atm, co=7.880 脳 10 -2 渭 m / s, a0. 90-2 渭 m / s, a0. 902-P model DMSOL: Lp0. 168 渭 m/min atm, omega 9.081 脳 10 -2 渭 m / s; EGO: Lpn 0. 174 渭 m/min atm, 蠅 8. 009 脳 10 -2 渭 m / s. To further optimize the cryopreservation agent in neural stem cells into the introduction and elution program to provide a reference.
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2128414