【摘要】：神經(jīng)肽Y（Neuropeptide Y，NPY）是一種由36個(gè)氨基酸組成，結(jié)構(gòu)類似于鳥胰多肽（avian pancreatic polypeptide，APP）及多肽YY（peptide YY）的一種神經(jīng)遞質(zhì)，其豐富地表達(dá)于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。當(dāng)交感神經(jīng)激活時(shí)，NPY可與去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）共同被交感神經(jīng)末梢所釋放。NPY通過六種不同的G蛋白偶聯(lián)受體在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的作用。在中樞，NPY可影響學(xué)習(xí)、記憶、攝食等功能；而在外周，它對(duì)循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)均產(chǎn)生影響。 肝臟是人體最大的腺體，是新陳代謝的重要器官。肝臟被大量的傳入神經(jīng)和傳出神經(jīng)（交感和副交感神經(jīng)）所支配。研究表明，在人類肝臟中，NPY能神經(jīng)元是人體肝臟中最為豐富的肽能神經(jīng)元。NPY能神經(jīng)元大量分布于肝動(dòng)脈、門靜脈以及膽道周圍，并且直接貫穿于肝小葉，與肝細(xì)胞直接接觸，從而形成一個(gè)復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。有研究報(bào)道交感神經(jīng)能夠通過末梢釋放NPY和NE調(diào)節(jié)肝血管的血液量，而NPY對(duì)肝細(xì)胞的作用卻鮮有報(bào)道。 基于納升級(jí)二維液相-串聯(lián)質(zhì)譜（2D-nano-LC-MS/MS）的鳥槍法蛋白組學(xué)研究技術(shù)是指將目標(biāo)蛋白組進(jìn)行酶解形成混合肽段后，采用納升級(jí)二維液相色譜對(duì)肽段混合物進(jìn)行分離，接著通過串聯(lián)質(zhì)譜逐一檢測(cè)特征性肽段，所得數(shù)據(jù)運(yùn)用SEQUEST等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而高通量、高靈敏度和高精度地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。 為研究NPY對(duì)肝細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制，我們以人肝細(xì)胞L-02為研究對(duì)象，進(jìn)行了以下工作： 1、采用MTT法測(cè)定不同濃度的NPY對(duì)人肝細(xì)胞L-02活力的影響。 2、應(yīng)用Western blot檢測(cè)NPY刺激人肝細(xì)胞L-02后凋亡標(biāo)志性蛋白的變化。 3、應(yīng)用基于納升級(jí)二維液相-串聯(lián)質(zhì)譜的鳥槍法蛋白組學(xué)技術(shù)研究人肝細(xì)胞L-02在經(jīng)過NPY刺激后，其蛋白表達(dá)譜的變化，從中挖掘NPY引起人肝細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路； 4、應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析蛋白組數(shù)據(jù)，同時(shí)查閱文獻(xiàn)，篩選與凋亡密切相關(guān)的蛋白，發(fā)掘NPY引起人肝細(xì)胞凋亡的可能信號(hào)通路，并應(yīng)用Western blot對(duì)部分蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行驗(yàn)證； 5、應(yīng)用mTOR的抑制劑雷帕霉素，進(jìn)一步觀察mTOR信號(hào)通路在NPY引起人肝細(xì)胞凋亡中的作用。 主要工作結(jié)果如下： 1、 NPY可呈劑量依賴性明顯降低人肝細(xì)胞L-02的活力，且1nM NPY即具有顯著作用。 2、 NPY可導(dǎo)致L-02細(xì)胞凋亡標(biāo)志性蛋白表達(dá)發(fā)生明顯變化，L-02細(xì)胞在經(jīng)過NPY的刺激后，其剪切caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2家族中Bax、Bad表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)。結(jié)果顯示，NPY可引起L-02細(xì)胞的凋亡。 3、應(yīng)用基于納升級(jí)二維液相-串聯(lián)質(zhì)譜的鳥槍法蛋白組學(xué)研究技術(shù)，10nM的NPY刺激L-02細(xì)胞后，，有317個(gè)蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)差異，其中80個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，237個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。經(jīng)過查閱篩選，與凋亡密切相關(guān)的蛋白有12個(gè)，我們關(guān)注其中的4個(gè)蛋白，即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），細(xì)胞色素c（cytochrome c），核糖體蛋白S6激酶（S6K）和熱休克蛋白70（Hsp70）。mTOR可通過激活S6K而磷酸化BAD，Hsp70可通過JNK來調(diào)節(jié)cytochrome c的釋放，而cytochrome c則能夠活化caspase-9從而剪切caspase-3，引起細(xì)胞的凋亡。 4、經(jīng)Western blot的進(jìn)一步驗(yàn)證，mTOR、cytochrome c、S6K和Hsp70的表達(dá)與納升級(jí)二維液相-串聯(lián)質(zhì)譜所檢測(cè)的表達(dá)模式一致，mTOR、S6K、cytochrome c表達(dá)上調(diào)，Hsp70表達(dá)下調(diào)。 5、應(yīng)用mTOR的抑制劑雷帕霉素后，NPY引起L-02細(xì)胞的凋亡被逆轉(zhuǎn)。 綜上所述，NPY可呈劑量依賴地促進(jìn)人肝細(xì)胞的凋亡。10nM NPY刺激L-02細(xì)胞24h后，12個(gè)與凋亡相關(guān)的蛋白發(fā)生變化，其中4個(gè)具有密切的聯(lián)系，我們進(jìn)一步推測(cè)mTOR/S6K/BAD、Hsp70/cytochrome c/caspase-3可能是NPY引起人肝細(xì)胞凋亡的兩條重要信號(hào)通路。應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素后進(jìn)一步表明，雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)NPY的促人肝細(xì)胞凋亡作用。研究表明，NPY可通過激活人肝細(xì)胞內(nèi)在凋亡通路而使其凋亡，同時(shí)基于納升級(jí)二維液相-串聯(lián)質(zhì)譜的鳥槍法蛋白組學(xué)是一種有效的挖掘信號(hào)通路的方法。
[Abstract]:Neuropeptide Y ( NPY ) is a neurotransmitter composed of 36 amino acids , which is similar to that of bird pancreatic polypeptide ( APP ) and polypeptide YY ( peptide YY ) , which is abundantly expressed in the central and peripheral nervous system . NPY can be released by sympathetic nerve endings in combination with noradrenaline ( NE ) when sympathetic nerve is activated . NPY plays a wide role in vivo by six different G protein coupled receptors . NPY can influence learning , memory and food consumption .
At the periphery , it has an impact on circulatory system , reproductive system and digestive system .

The liver is the largest gland in the human body and is an important organ of metabolism . The liver is dominated by a large number of afferent nerves and afferent nerves ( sympathetic and subsympathetic nerve ) . The study shows that NPY - ergic neurons are the most abundant peptide - energy neurons in human liver . NPY - ergic neurons are distributed directly around the hepatic artery , portal vein and biliary tract , thus forming a complex neural network . It is reported that the sympathetic nerve can release NPY and NE through the distal tip to regulate the blood volume of the liver blood vessel , and NPY has little effect on the liver cells .

Based on nanoscaled 2D - nano - LC - MS / MS , the technique of protein group is to separate the peptide segment mixture by nano - escalation two - dimensional liquid chromatography , then the characteristic peptide segment is detected one by one by tandem mass spectrometry , and the data is analyzed by using software such as EST , so that the protein can be identified with high flux , high sensitivity and high accuracy .

In order to study the effect of NPY on liver cells and its molecular mechanism , we performed the following work with human hepatocytes L - 02 as the research object :

1 . The effect of NPY on the activity of human hepatocytes L - 02 was determined by MTT assay .

2 . Western blot was used to detect the changes of apoptosis marker protein in human hepatocytes after L - 02 .

3 . The protein expression profile of human hepatocytes L - 02 after NPY stimulation was studied by the technique of nanogun proteomic technique based on nano - escalation two - dimensional liquid - tandem mass spectrometry .


4 . Using bioinformatics software to analyze the proteome data , meanwhile , consult the literature , screen the protein related to apoptosis , explore the possible signal pathway of NPY - induced apoptosis of human hepatocytes , and verify the expression of some proteins by Western blot ;


5 . Using rapamycin inhibitor rapamycin , we further observed the role of mtor signaling pathway in NPY - induced apoptosis in human hepatocytes .

The main results are as follows :

1 . NPY may dose - dependently decrease the viability of human hepatocytes L - 02 and 1 nM NPY has a significant effect .

2 . NPY could induce apoptosis of L - 02 cells . The expression of caspase - 3 was up - regulated in L - 02 cells . The expression of Bax , Bad in Bcl - 2 family was up - regulated and the expression of Bcl - 2 was down - regulated .

3 . The expression of 317 proteins was differentially expressed after 10 nM NPY - stimulated L - 02 cells . Among these proteins , there were 12 proteins , including mammalian rapamycin target protein , cytochrome c , ribosomal protein S6 kinase and heat shock protein 70 ( Hsp70 ) .

4 . After further verification by Western blot , the expression of mtor , cdc , s6k and Hsp70 was consistent with the expression pattern detected by nano - escalation two - dimensional liquid - tandem mass spectrometry , and the expression of mtor , s6k , cdc was up - regulated , and the expression of Hsp70 was down regulated .

5 . NPY causes apoptosis of L - 02 cells to be reversed after rapamycin is applied to rapamycin .

In conclusion , NPY can promote apoptosis of human hepatocytes in a dose - dependent manner . After 10 nM NPY - stimulated L - 02 cells for 24 h , 12 cells related to apoptosis have changed . Four of them have close ties . We further speculated that the expression of Hsp70 / bcl - c / caspase - 3 might be an important signaling pathway for the apoptosis of human hepatocytes .
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 褚啟龍;哈建利;王愛國;;氟致人肝細(xì)胞DNA損傷與細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2009年05期

2 歐陽渭川;;血吸蟲性肝纖維化肝細(xì)胞的鈉含量[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);1982年02期

3 王國欽;;在鼠傷寒沙門氏菌致突變?cè)囼?yàn)中比較人肝細(xì)胞和人肝S9與大鼠肝制劑活化系統(tǒng)對(duì)激活誘變劑的影響[J];國外醫(yī)學(xué).衛(wèi)生學(xué)分冊(cè);1986年06期

4 趙曉琴;龍祖安;;乙型病毒性肝炎免疫發(fā)病機(jī)理有關(guān)問題[J];蛇志;1993年03期

5 唐南洪,陳燕凌,王曉茜,李秀金,殷鳳峙;微載體培養(yǎng)L02人肝細(xì)胞應(yīng)用于生物人工肝的初步研究[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2001年06期

6 楊建設(shè),李文建,王菊芳,王轉(zhuǎn)子,夏景光,金曉東,高清祥;γ射線照射人正常肝細(xì)胞染色體損傷的修復(fù)[J];中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志;2005年05期

7 張志;周煥城;李治國;潘明新;王忠;高毅;;纖維素與明膠微載體微重力培養(yǎng)肝細(xì)胞的比較[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年04期

8 崔忻;姚文芳;薛毅瓏;;轉(zhuǎn)染SV40永生化基因的正常成人肝細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)化功能的測(cè)定[J];軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào);2010年11期

9 陳文勝;金鳳林;;肝特異性抗原[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;1981年04期

10 朱良;;在人肝細(xì)胞中體外培養(yǎng)間日瘧獲得成功[J];國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志;1984年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 楊儉;郝純澍;張銀娣;沈建平;;白介素-6下調(diào)人肝細(xì)胞藥物代謝酶CYP3A4分子機(jī)制研究[A];2008第十一次全國臨床藥理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

2 陳永平;;肝細(xì)胞移植的研究進(jìn)展[A];第十次浙江省中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

3 陳永平;;肝細(xì)胞移植的研究進(jìn)展[A];2008年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

4 林滬;毛青;王宇明;;L02人肝細(xì)胞在人鼠嵌合肝中增殖的實(shí)驗(yàn)研究[A];病毒性肝炎慢性化、重癥化基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

5 左雅慧;王放;王小莉;李建國;王仲文;童建;;Co60γ射線照射后人肝細(xì)胞子代克隆的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[A];中國毒理學(xué)會(huì)放射毒理專業(yè)委員會(huì)第七次、中國毒理學(xué)會(huì)免疫毒理專業(yè)委員會(huì)第五次、中國環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)致突專業(yè)委員會(huì)第二次、中國環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)致畸專業(yè)委員會(huì)第二次、中國環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)致癌專業(yè)委員會(huì)第二次全國學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

6 權(quán)月;;肝細(xì)胞移植治療急性肝功能衰竭的研究進(jìn)展[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2007年

7 于一;郭艷芳;張秀蘭;;神經(jīng)肽對(duì)吞噬細(xì)胞功能的影響[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第五次會(huì)議論文摘要匯編[C];1992年

8 王在照;曲凌云;相建海;;中國對(duì)蝦兩種神經(jīng)肽基因的克隆及序列分析[A];甲殼動(dòng)物學(xué)分會(huì)成立20周年暨劉瑞玉院士從事海洋科教工作55周年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文（摘要）集[C];2002年

9 潘小平;杜維波;盛國平;虞曉鵬;曹紅翠;李君;陳瑜;黃建榮;盛吉芳;李蘭娟;;永生化人肝細(xì)胞系的建立及其鑒定[A];2008年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

10 黃俏庭;潘集陽;劉亞平;;原發(fā)性失眠患者血漿神經(jīng)肽Y水平的對(duì)照研究[A];中國睡眠研究會(huì)第六屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 吳一福;四軍醫(yī)大首次構(gòu)建成永生化胚胎肝細(xì)胞系[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

2 編譯 王金元;神奇生物開關(guān)控制人體胖瘦[N];北京科技報(bào);2007年

3 廖雅靜;走向藥物研發(fā)前沿的生物標(biāo)記物[N];中國醫(yī)藥報(bào);2005年

4 張超群 范曉莉;神經(jīng)肽P物質(zhì)可輔助移植肌蒂生長[N];中國醫(yī)藥報(bào);2005年

5 胥曉琦;兩位科學(xué)家的跨世紀(jì)之爭(zhēng)[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2003年

6 寧在蘭;藥不可隨意用[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2006年

7 郜婕;研究發(fā)現(xiàn)：魚兒也會(huì)“賴床”也會(huì)失眠[N];新華每日電訊;2007年

8 張?zhí)锟?想減肥 多睡覺[N];健康報(bào);2008年

9 基因潮編譯;蛋日組學(xué)市場(chǎng)魅力不再？[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2002年

10 金振蓉;專家預(yù)測(cè)未來十年十大科技突破[N];光明日?qǐng)?bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 鄧一平;Syndecan-1脫落介導(dǎo)人肝細(xì)胞對(duì)VLDL結(jié)合攝取能力影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2011年

2 吳根生;SV40 T介導(dǎo)的人類胚肝上皮細(xì)胞的體外永生化及其機(jī)制探討[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1992年

3 賀連香;半乳糖化白蛋白磁性阿霉素納米粒聯(lián)合交變磁場(chǎng)對(duì)肝癌的影響研究[D];中南大學(xué);2007年

4 王陳;基于二維液相色譜技術(shù)的元胡活性成分篩選及其藥效和毒性機(jī)制的蛋白組學(xué)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

5 章益民;HepLL細(xì)胞海藻酸—?dú)ぞ厶俏⒛野蛢龃嫜芯縖D];浙江大學(xué);2007年

6 蔣黎;基于Bcl-2抗Fas凋亡特性的HepaRG細(xì)胞—鼠嵌合肝動(dòng)物模型的建立[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

7 史娟;腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)TRAIL及DR5單鏈抗體表達(dá)治療肺癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

8 趙正卿;神經(jīng)肽S在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)及其對(duì)睡眠/覺醒和認(rèn)知功能影響的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

9 左雅慧;輻射誘發(fā)HL-7702細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性研究[D];蘇州大學(xué);2010年

10 崔建國;輻射致癌相關(guān)蛋白質(zhì)篩選及其表達(dá)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王霞;神經(jīng)肽Y引起人肝細(xì)胞凋亡機(jī)制的比較蛋白組學(xué)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

2 沈芳芳;胰高血糖素樣肽-1對(duì)正常人肝細(xì)胞作用機(jī)制的研究-PI3K通路[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

3 張瑜;殼寡糖對(duì)人肝細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞凋亡的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2010年

4 戴永江;黃白液對(duì)男性復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者神經(jīng)肽與精液質(zhì)量的相關(guān)性研究[D];湖南中醫(yī)學(xué)院;2004年

5 鄭玉明;腦出血患者降鈣素基因相關(guān)肽和內(nèi)皮素及其與血腫周圍腦水腫形成關(guān)系的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2005年

6 李秀國;三種神經(jīng)肽在復(fù)發(fā)性鼻息肉形成初期的表達(dá)及其意義[D];山東大學(xué);2005年

7 任杰;舒風(fēng)寧沖劑治療原發(fā)性三叉神經(jīng)痛的臨床研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2006年

8 鄧江山;芪藤通絡(luò)飲防治實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變發(fā)生的實(shí)驗(yàn)研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2007年

9 韓麗麗;射頻熱凝術(shù)聯(lián)合硬膜外腔神經(jīng)阻滯治療腰椎間盤突出癥的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

10 張彥萍;血管緊張素Ⅱ?qū)θ烁渭?xì)胞上皮—間質(zhì)表型轉(zhuǎn)換的影響及作用機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2128175