【摘要】：哺乳動物造血的發(fā)生與發(fā)育是一個非常復雜的過程，具有嚴格的時空特異性，在胚胎發(fā)育過程中造血位點出現(xiàn)于不同的解剖部位，分別為原始造血和永久造血。原始造血最早是由出現(xiàn)于胚胎第7天（E7.0）的卵黃囊（YS）“血島”產(chǎn)生原始紅細胞，和成年人的紅血胞在大小形狀、基因表型、細胞激素需求上有差別。但永久造血起源于何處仍存在爭議，目前主流認為胚胎初生造血干細胞（HSCs）是多個造血位點共同起源，即卵黃囊和胚體的P-Sp/AGM區(qū)，還有認為尿囊和胎盤也可能是發(fā)生部位，隨后遷移至胎肝大量擴增。研究表明卵黃囊也可產(chǎn)生永久造血干/祖細胞，但由于微環(huán)境和其他可能的原因，卵黃囊來源的造血干/祖細胞自我更新能力弱，分化能力強，數(shù)量迅速減少。因此，卵黃囊造血表現(xiàn)為胚胎發(fā)育過程中第一波的短暫性造血，并不是隨后發(fā)生的胎肝和骨髓造血的主要來源。近期的一系列研究表明，在E8.25的卵黃囊造血中可以檢測出胚胎發(fā)育過程中第一波的一過性造血，隨著循環(huán)系統(tǒng)的形成，在胚體其他部位也出現(xiàn)造血細胞，E8.5的主動脈旁臟層（P-Sp）也出現(xiàn)一波短暫性造血；真正具有長期重建各系造血功能的HSC出現(xiàn)在E10.0的胚內(nèi)AGM區(qū)，并且進一步定位在其中的背主動脈（dorsal aorta，DA）。隨后,在胚胎其他的大血管，如卵黃囊動脈以及臍動脈中也發(fā)現(xiàn)有造血前體細胞，而且在上述動脈管壁內(nèi)可見造血細胞簇。由于血液循環(huán)系統(tǒng)的建立，定位胚胎期產(chǎn)生的造血干細胞的發(fā)生位點是個非常復雜的過程，在研究中，使用合適的胚胎期造血細胞的標志成為研究的關(guān)鍵點之一。 CD41，又稱αIIb整合素，是眾所周知的巨核細胞和血小板的特異性標志，最近研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎發(fā)育過程中CD41的表達標志著原始造血和永久造血的啟動發(fā)生，并且胚胎發(fā)育過程中CD41在YS“血島”，AGM區(qū)和胎盤中都有階段性表達。內(nèi)皮細胞、造血細胞和間質(zhì)細胞在發(fā)育過程中關(guān)系密切，目前的研究報道主要集中在CD41+細胞向造血分化潛能的研究，然而，小鼠胚胎時期CD41+細胞除造血之外的多向分化潛能尚未闡明清晰。因此，我們擬通過流式細胞儀分選胚胎11.0天（E11.0）的AGM區(qū)，卵黃囊和胚胎循環(huán)血（CB）中的CD41+細胞，并研究其向間質(zhì)細胞分化的潛能，為研究胚胎造血發(fā)育調(diào)控奠定良好的基礎。首先我們在體外半固體培養(yǎng)基中進行CD41~+細胞造血分化潛能研究，AGM區(qū)、YS和CB來源的CD41~+細胞生成造血各譜系的能力有一定差異；隨后主要在體內(nèi)外研究了CD41~+細胞向間質(zhì)細胞分化的潛能：（1）體外建立間質(zhì)細胞誘導體系，探討小鼠胚胎發(fā)育過程中AGM區(qū)、YS和CB來源的CD41~+細胞向間質(zhì)細胞分化潛能；（2）建立一個體內(nèi)評價CD41~+細胞向間質(zhì)細胞分化的動物模型，分選GFP轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎發(fā)育過程中AGM區(qū)、YS和CB來源的GFP~+CD41~+細胞進行體內(nèi)移植，通過免疫熒光檢測間質(zhì)細胞分化標志vimentin、α-SMA、epimorphin（EPM）的表達情況來評估其向間質(zhì)細胞分化能力；（3）根據(jù)CD41表達強弱分析和探討CD41~+細胞中具有間質(zhì)細胞分化潛能的細胞亞群。我們體外實驗發(fā)現(xiàn)，AGM區(qū)的CD41~+細胞形成的貼壁的成纖維樣間質(zhì)細胞增殖能力較強，至少能擴增5-6代；YS來源的CD41~~+細胞也能生成貼壁的成纖維樣間質(zhì)細胞，但其只能擴增1-2代，增殖能力較弱；CB來源的CD41~~+細胞只有很少一部分能生成貼壁的成纖維樣間質(zhì)細胞，大多都是圓形不貼壁的造血細胞。免疫熒光結(jié)果表明，無論AGM區(qū)還是YS來源的成纖維樣間質(zhì)細胞都表達成纖維母細胞標志vimentin和α-SMA，而CB中只有極少量的甚至無vimentin和α-SMA的表達。體內(nèi)實驗通過建立半致死劑量輻射損傷小鼠模型，移植GFP~+CD41~+細胞后，從第二周開始直至第四周，檢測受體小鼠外周血中GFP表達情況，發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)來源的GFP~+CD41~+細胞造血重建能力遠遠強于YS和CB來源的GFP~+CD41~+細胞，YS來源的GFP~+CD41~+細胞呈現(xiàn)短暫性造血重建；檢測受體骨髓中GFP~+CD45~+嵌合情況，發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)來源的GFP~+CD41~+細胞能歸巢到受體骨髓進行造血重建，而YS和CB來源的GFP~+CD41~+細胞很少歸巢至骨髓。與此同時，我們在AGM區(qū)和YS來源的GFP~+CD41~+細胞移植組小鼠肺部切片中發(fā)現(xiàn)有GFP~+細胞，并沿著血管外周形成管腔樣結(jié)構(gòu)，對這些GFP~+細胞的進一步鑒定表明其表達間質(zhì)細胞標志vimentin/α-SMA/EPM，并還檢測到有少部分細胞表達造血/內(nèi)皮細胞標志CD31~+，而在CB來源的GFP~+CD41~+細胞移植小鼠肺部并沒有發(fā)現(xiàn)GFP~+細胞的分布。為了進一步確定CD41~+細胞中具有間質(zhì)分化潛能的細胞亞群，我們根據(jù)CD41表達強弱，流式分選出AGM區(qū)和YS來源的CD41~(int)和CD41high亞群進行體外間質(zhì)細胞誘導分化，研究表明AGM區(qū)和YS來源的CD41~+細胞中具有間質(zhì)細胞分化潛能的一群細胞主要在CD41~(int)中。隨后又對AGM區(qū)和YS來源的CD41~(int)做了進一步鑒定研究，聯(lián)合利用CD34標志雙色分選出CD41~(int)CD34-和CD41~(int)CD34~+細胞，發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)來源CD41~(int)CD34-細胞具有間質(zhì)細胞分化能力，而CD41~(int)CD34~+細胞未觀察到間質(zhì)分化潛能；YS來源CD41~(int)CD34-細胞和CD41~(int)CD34~+細胞都具有間質(zhì)細胞分化潛能。 綜上所述，我們的研究初步表明：（1）AGM區(qū)、YS和CB來源的CD41~+細胞體外除了能向造血各譜系分化外，在體內(nèi)外一定條件下，還能向間質(zhì)細胞分化，且AGM區(qū)來源的CD41~+細胞形成的間質(zhì)細胞增殖能力遠遠強于YS和CB來源的CD41~+細胞。（2）體內(nèi)移植實驗中，只有AGM區(qū)和YS來源的CD41~+具有間質(zhì)分化能力，且AGM區(qū)來源的CD41~+細胞造血重建能力強于YS和CB來源的CD41~+細胞。（3）AGM區(qū)和YS來源的CD41~+細胞中具有間質(zhì)細胞分化潛能的一群細胞主要在CD41~(int)中。聯(lián)用CD34標志雙標分選出CD41~(int)CD34-和CD41~(int)CD34~+細胞中，AGM區(qū)來源的CD41~(int)CD34~-細胞具有間質(zhì)細胞分化能力，而CD41~(int)CD34~+細胞未觀察到；YS來源的CD41~(int)CD34-細胞和CD41~(int)CD34~+細胞都具有間質(zhì)細胞分化潛能。 缺血性疾病是一類嚴重威脅人類健康和生存質(zhì)量的疾病，包括心腦血管缺血和嚴重肢體缺血損傷。目前，臨床治療手段主要包括藥物治療、血管旁路重建、血管腔內(nèi)成形或支架術(shù)等,治療方法無實質(zhì)性改進，療效也不理想。“治療性血管新生”（therapeutic neovascularization）的提出為缺血性疾病的治療提出新策略，應用內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）植入術(shù)可促進缺血組織的血管新生和側(cè)枝循環(huán)形成，增強血流灌注，治療缺血性疾病。外周血中EPCs是同時表達Sca-1和Flk-1表面標志的一群可向血管內(nèi)皮分化的高增殖潛能前體細胞，可替代凋亡或壞死的內(nèi)皮細胞，參與損傷后的血管新生。通過外源性移植EPCs可促進缺血心肌和肢體骨骼肌血管的新生。近年來的研究發(fā)現(xiàn)干細胞動員藥物對治療缺血性疾病有一定的療效，可動員自體骨髓中的干細胞到損傷組織，促進血管新生、恢復缺血組織功能，為缺血性疾病的治療提供了新的思路。 干細胞動員過程復雜，SDF-1α/CXCR4軸在骨髓干細胞的遷移與歸巢中發(fā)揮重要的作用。SDF-1α的趨化作用由其受體CXCR4介導。骨髓中HSCs和EPCs高表達CXCR4，基質(zhì)細胞分泌SDF-1α對此類細胞具有趨化作用。干細胞歸巢與動員是個互為鏡像的動態(tài)過程。通過擾動SDF-1α/CXCR4軸可大量動員骨髓干細胞進入外周血。缺血、缺氧及組織損傷等病理變化均可使缺血損傷組織SDF-1α的分泌顯著增強，形成SDF-1α濃度梯度差，骨髓中高表達CXCR4的EPCs能夠沿著SDF-1α的濃度梯度遷移至損傷部位參與修復。但正常外周血中EPCs數(shù)量很低，這種代償性的EPCs動員過程不足以用來修復損傷組織，通過干細胞動員藥物則能打破這一限制，大量動員骨髓中EPCs并遷移至缺血組織，促進血管新生，恢復缺血組織功能。目前研究發(fā)現(xiàn)的細胞因子包括G-CSF，GM-CSF，VEGF和雌二醇（estradiol），CXCR4拮抗劑AMD3100，及一氧化氮（NO）和血管生成素（angiopoietin）均可不同程度動員骨髓干細胞進入外周血。這些干細胞動員劑對內(nèi)皮祖細胞的動員效果及促進缺血組織恢復的能力還需進一步改進，部分動員劑反復給藥會引發(fā)副作用。因此，研發(fā)新型、高效、無毒副作用的干細胞動員劑成為研究和開發(fā)的熱點。 本研究中，我們首次研究發(fā)現(xiàn)了一種飽和胺類小分子化合物Me6可持續(xù)大量動員EPCs，促進缺血組織血管的新生，對下肢缺血性疾病的修復具有一定的作用。我們研究證明Me6皮下給藥后小鼠的外周血和脾臟中Sca-1+Flk-1+細胞含量均顯著增加。Me6在給藥12h后的通過流式檢測顯示外周血中內(nèi)皮祖細胞Sca-1+Flk-1+比例是正常血中的3倍（Me61.98±0.13%vs. vehicle control0.71±0.09%），統(tǒng)計分析與對照組間存在顯著性差異（**p0.01），直至72h后外周血中Sca-1+Flk-1+比例恢復正常。脾臟具有募集內(nèi)皮祖細胞的功能，同時在此作用時間點，脾臟中這群Sca-1+Flk-1+細胞（Me67.33±0.71%vs. vehicle control3.3±0.37%）的比例也上調(diào)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)與正常對照組的脾臟中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量具有統(tǒng)計學意義（**p0.01）。流式檢測外周血還發(fā)現(xiàn)Me6還能顯著上調(diào)CD34的表達（Me619.5±1.4vs. vehicle control14.8±0.76），而間充質(zhì)干細胞相關(guān)標志并沒有明顯變化，CD29有輕微上調(diào)，CD105沒有變化。 為進一步評估Me6動員的EPCs促進缺血下肢損傷修復的功能，我們建立了小鼠下肢缺血模型，將Me6或PBS處理小鼠的外周血單個核細胞移植到小鼠下肢缺血損傷肌肉組織中，應用激光多普勒（LDPI）指數(shù)（由缺血下肢與正常下肢之比值來計算）經(jīng)行評估血流灌注恢復效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植了Me6給藥小鼠的外周血細胞能明顯促進缺血下肢血流灌注的恢復。我們進一步觀察了Me6對下肢缺血損傷小鼠的EPCs動員效果。建立小鼠下肢缺血模型在第7天給藥檢測各組外周血中Sca-1+Flk-1+比例(Me63.09±0.5%; AMD31003.17±0.4%; vehicle control1.49±0.1%)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明Me6能有效動員下肢缺血損傷小鼠骨髓中的EPCs至外周血中。進一步研究結(jié)果證明Me6能直接動員自體骨髓中的EPCs進入外周血，進而被募集到缺血損失組織，分化為血管內(nèi)皮參與血管新生。對下肢缺血損傷小鼠皮下注射Me6后的治療效果觀察中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Me6治療的小鼠，其缺血損傷的下肢血流灌注得到了很好的恢復，新生血管數(shù)量顯著高于對照組。結(jié)果表明，Me6能大量高效地動員自體骨髓中Sca-1+Flk-1+內(nèi)皮祖細胞到外周血，并遷移至缺血部位增殖分化，參與新生血管的形成，增強血流灌注，改善下肢遠端血運和氧供。通過初步探索小分子Me6的動員EPCs作用機理發(fā)現(xiàn)：Me6通過上調(diào)骨髓中MMP-9的表達和釋放，從而降解骨髓基質(zhì)上清中SDF-1α的濃度，，并從12h一直持續(xù)到48h（49.7%±2.6%）與缺血受損部位之間形成SDF-1α濃度梯度差，同時還明顯上調(diào)骨髓單個核細胞的CXCR4的表達（Me654.9±6.1%vs. vehicle control29.1±4.3%），并能干擾SDF-1/CXCR4信號通路，降低EPCs對骨髓“龕”的附著能力，促使其從骨髓中釋放進入外周血，并向缺血受損組織遷移，進而促進血管新生和功能恢復。我們的研究證明，小分子Me6可持續(xù)大量安全有效地動員自體EPCs，促進缺血損傷部位血管再生與血流灌注，修復下肢缺血損傷。進一步開發(fā)Me6在治療下肢缺血性疾病方面的成藥性等，有望為臨床治療相關(guān)疾病提供很好的治療手段。此外，心腦血管缺血性疾病與肢體缺血的病變機制相類似，這種自體血管再生手段將為其它缺血性疾病的治療提供有益的參考。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：2125454