【摘要】：新型免疫抑制藥物的研制及發(fā)展，為整形外科在異體復(fù)合組織移植領(lǐng)域的穩(wěn)步發(fā)展帶來了新的機遇。然而，異體復(fù)合組織移植（CTA）的發(fā)展遠遠不似內(nèi)臟器官移植一樣迅速，究其根本，是因為異體復(fù)合組織移植物組分復(fù)雜，并且抗原性不均一。自1998年首次手移植被Dubernard成功實施以來，到目前為止,在臨床上已完成超過60例手移植和23例異體顏面移植。第一例異體顏面移植在法國成功施行手術(shù)后，曾經(jīng)發(fā)生2次急性排斥反應(yīng)，第二例患者是在本科室成功實施后，術(shù)后也發(fā)生了3次急性排斥反應(yīng)。加大免疫抑制劑用量是使排斥反應(yīng)得到控制的有效方法，但是往往會出現(xiàn)各種棘手的并發(fā)癥如急性腎衰、高血壓癥等。鑒于上述原因，尋找可以使免疫抑制劑用量最小化的方法，已成為CTA移植領(lǐng)域重點研究的項目。 免疫應(yīng)答的一般規(guī)律同樣適用于異體復(fù)合組織移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，首先，外來的異體抗原被免疫識別之后激活機體免疫系統(tǒng)，繼而產(chǎn)生對移植物的免疫排斥反應(yīng)，也就是說，阻斷免疫應(yīng)答中的任何一個環(huán)節(jié)，都可以實現(xiàn)對移植免疫耐受的誘導(dǎo)。 細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4抗體融合蛋白（CTLA4-Ig）可以阻斷CD28-B7途徑，能有效誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)生。樹突狀細胞毋庸置疑是最主要的抗原提呈細胞，在其表面可以高水平表達MHC-II類分子以及CD80、CD86等共刺激分子，通過B7分子與CD28的結(jié)合，開啟第二信號刺激途徑，，從而激活初始T細胞。成熟的樹突狀細胞具有淋巴歸巢的特性，因此，CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染的成熟樹突狀細胞有可能成為細胞回輸治療方案的備選細胞。 目的： 研究CTLA4-Ig直接淋巴結(jié)注射后其表達效率、CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染成熟樹突狀細胞后相關(guān)基因的表達，局部注射轉(zhuǎn)染后的成熟樹突狀細胞后觀察CTLA4-Ig在引流淋巴結(jié)內(nèi)的表達，探索淋巴結(jié)直接基因治療方法的可行性；試圖通過局部細胞治療誘導(dǎo)免疫耐受，降低全身免疫抑制劑的用量，為同種異體復(fù)合組織移植探索新途徑。 方法： 1．大鼠淋巴結(jié)內(nèi)注射CTLA4-Ig重組慢病毒，觀察CTLA4-Ig在淋巴結(jié)內(nèi)的表達。 2．貼壁培養(yǎng)法體外誘導(dǎo)成熟樹突狀細胞，進行形態(tài)學鑒定、活性及表型鑒定，體外鑒定其免疫學功能。 3．體外試驗研究CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠成熟樹突狀細胞，觀測CTLA4-Ig的表達時間及表達高峰。 4．體內(nèi)試驗研究CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染的成熟樹突狀細胞于大鼠引流淋巴結(jié)的定向表達。 結(jié)果： 1．實時熒光定量PCR及冰凍切片示，空白對照及陰性對照組淋巴結(jié)內(nèi)均無CTLA4-Ig的表達。CTLA4-Ig重組慢病毒淋巴結(jié)內(nèi)注射組有明顯的CTLA4-Ig表達。 2．光鏡見培養(yǎng)的成熟樹突狀細胞集落分散，懸浮，分布較均勻。掃描電鏡見細胞表面大量褶皺與粗細不等的突起。流式細胞術(shù)顯示成熟樹突狀細胞表面的DC功能相關(guān)抗原MHC II、CD80、CD86均高表達。功能試驗檢測其分泌IL-12能力較未成熟樹突狀細胞強，混合淋巴細胞反應(yīng)顯示其有強的刺激T細胞增殖的能力。活細胞率為（80.34±1.25）%。 3．慢病毒轉(zhuǎn)染成熟樹突狀細胞76h后，于倒置熒光顯微鏡下可觀察到熒光表達。隨時間延長，熒光表達增多，細胞形態(tài)亦出現(xiàn)老化。轉(zhuǎn)染后第7d細胞明顯老化。Q-PCR示CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染成熟樹突狀細胞第3天，于mRNA水平有CTLA4-Ig的表達，western blotting檢測所示結(jié)果與Q-PCR一致。 4．距大鼠腋固有淋巴結(jié)處2公分皮下緩慢注射所收獲的CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染后第3天的DCs，術(shù)后第4天取材，Q-PCR顯示注射CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染的DCs組于淋巴結(jié)內(nèi)可檢測到CTLA4-Ig的表達。 結(jié)論： 1．CTLA4-Ig重組慢病毒淋巴結(jié)內(nèi)直接注射可行,但范圍局限且損傷較大。 2．細胞治療初步顯示可行，其效果需在異體復(fù)合組織移植模型中做進一步的驗證。
[Abstract]:The development and development of novel immunosuppressive drugs have brought new opportunities for the steady development of orthopedic surgery in the field of allograft transplantation . However , the development of allograft tissue transplantation ( CTA ) is far less than that of internal organ transplantation .

The general rule of immune response is also applicable to the occurrence of allograft rejection reaction , firstly , the foreign alloantigen is immune - recognized to activate the immune system of the organism , then the immune rejection reaction to the graft is generated , that is , the induction of transplantation immune tolerance can be realized by blocking any one of the immune responses .

The cytotoxic T - lymphocyte - associated antigen - 4 antibody fusion protein can block the CD28 - B7 pathway . It can effectively induce immune tolerance . Dendritic cells can express MHC - II molecules at a high level , and then activate the second signal stimulation pathway through the combination of B7 molecules and CD28 .

Purpose :

The expression efficiency and the expression of the related genes after the transfection of IL - 4 - Ig into mature dendritic cells were investigated . The expression of 4 - Ig in draining lymph nodes was observed after local injection of mature dendritic cells transfected into mature dendritic cells , and the feasibility of direct gene therapy for lymph nodes was explored .
Attempts to induce immune tolerance by local cell therapy , decrease the dosage of systemic immune inhibitor , and explore new ways for the transplantation of allogeneic composite tissue .

Method :

1 . In the lymph node of rats , the recombinant lentivirus was injected into the lymph node , and the expression of 4 - Ig in lymph node was observed .

2 . Induction of mature dendritic cells in vitro by adherent culture method , morphological identification , activity and phenotype identification , and in vitro identification of its immunological function .

3 . In vitro experiments were carried out to investigate the expression time and peak expression of 4 - Ig in mature dendritic cells transfected with the recombinant lentivirus .

4 . In vivo experiments were carried out to study the directional expression of the mature dendritic cells transfected with the recombinant lentivirus in rat draining lymph nodes .

Results :

1 . Real - time fluorescence quantitative PCR and frozen section showed that there were no IL - 4 - Ig expression in lymph nodes of blank control and negative control group .

2 . Light microscopy showed that the cultured mature dendritic cells were dispersed , suspended and distributed uniformly . The scanning electron microscope showed that there was a large number of wrinkles on the surface of mature dendritic cells . The expression of MHC II , CD80 and CD80 on the surface of mature dendritic cells was detected by flow cytometry . The function test showed that the IL - 12 ability of mature dendritic cells was higher than that of immature dendritic cells . The mixed lymphocyte reaction showed that it had strong ability to stimulate T cell proliferation .

3 . The fluorescent expression was observed under the inverted fluorescence microscope after the slow virus transfection of mature dendritic cells for 76h . The fluorescence expression increased with time , and the cell morphology was also aging . After transfection , the cells were aged significantly . Q - PCR showed that the recombinant lentivirus was transfected into mature dendritic cells on the third day , and the mRNA level was expressed by 4 - Ig . The results indicated by western blotting were consistent with Q - PCR .

4 . DCs were injected subcutaneously at 2 cm from the axillary lymph node of the rat , and the DCs were harvested at 3 days post - transfection . On the 4th day after operation , the DCs transfected with the recombinant lentivirus were detected by Q - PCR , and the expression of IL - 4 - Ig was detected in the lymph nodes .

Conclusion :

1 . Direct injection is feasible in the lymph node of the recombinant Lentivirus 4 - Ig , but the range is limited and the damage is large .

2 . The initial display of cell therapy is feasible , and its effect is to be further verified in the allograft model .
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：2125197