發(fā)布時間：2018-07-13 16:32

【摘要】：第一部分KLF4在小鼠表皮干細胞中的表達 目的：研究KLF4在小鼠表皮干細胞中的表達情況。 方法：使用干細胞特異性細胞表面標(biāo)志CD34和CD49f,分離純化小鼠毛囊隆突部干細胞(CD34+CD49f+細胞),通過實時定量RT-PCR方法檢測CD34+CD49f+富集細胞中KLF4的表達水平。建立KLF4/EGFP小鼠模型,體內(nèi)標(biāo)記表達KLF4的細胞,通過流式細胞術(shù)檢測表皮干細胞群中KLF4的表達情況,并通過標(biāo)記滯留實驗分析LRCs中有無KLF4的表達進一步驗證KLF4在慢周期干細胞中的表達。建立KLF4/CreERTM小鼠模型,在KLF4/CreERTM/Rosa26RLacZ轉(zhuǎn)基因小鼠中通過世系追蹤實驗檢測KLF4在表皮干細胞以及其子代細胞中的表達情況。 結(jié)果：KLF4在CD34+CD49f+毛囊干細胞中的表達水平較分化CD34-CD49f+細胞高。CD34+CD49f+細胞中58.6%的細胞表達KLF4/EGFP, Sca-1+CD49f+細胞中73%的細胞可以檢測到KLF4/EGFP信號。在純化的小鼠表皮細胞中,14.6%的細胞能夠滯留BrdU標(biāo)記,在這些標(biāo)記滯留細胞中,4.1%的細胞為KLF4/EGFP陽性。世系追蹤實驗顯示,X-Gal染色后,在皮膚組織的毛囊隆突部,皮脂腺和毛囊間表皮中均能檢測到藍色LacZ+ (KLF4+)干細胞及其子代細胞。 結(jié)論：結(jié)合上述各種實驗結(jié)果,我們證實KLF4在表皮干細胞中表達,表達KLF4的表皮干細胞具有標(biāo)記滯留功能并能增殖分化。[關(guān)鍵詞]KLF4；表皮干細胞；細胞表面標(biāo)志；標(biāo)記滯留；世系追蹤 第二部分KLF4在小鼠表皮干細胞中的功能研究 目的：檢測KLF4在小鼠表皮干細胞中的功能。 方法：建立他莫昔芬誘導(dǎo)的KLF4基因敲除小鼠模型,在成年小鼠腹腔內(nèi)注射他莫昔芬誘導(dǎo)KLF4基因敲除。使用免疫組織化學(xué)染色方法檢測KLF4敲除后小鼠皮膚組織的結(jié)構(gòu)變化。分離純化小鼠表皮細胞,通過流式細胞術(shù)檢測并比較野生小鼠與基因敲除組中毛囊隆突部干細胞(CD34+CD49f+細胞)和IFE干細胞(Sca-1+CD49f+細胞)數(shù)量。通過體外克隆形成實驗,比較野生小鼠與基因敲除組中表皮細胞體外克隆形成能力,并使用免疫熒光激活細胞分選術(shù)(FASC)分離兩組表皮細胞中的CD34+CD49f+細胞,比較其體外克隆形成能力。 結(jié)果：與對照野生小鼠相比,KLF4敲除小鼠的表皮組織內(nèi)毛囊顯著增生,基底細胞從單層增殖為多層。KLF4+/+小鼠表皮細胞中CD34+CD49f+毛囊干細胞和Sca-1+CD49f+IFE干細胞的比例分別為12.8%和68.73%,而KLF4-/-小鼠表皮細胞中干細胞的比例分別降至6.26%和52.6%。體外克隆形成實驗顯示KLF4敲除后表皮細胞體外形成的克隆數(shù)目從22下降至9。此外,KLF4+/+小鼠表皮CD34+CD49f+細胞體外能形成33個克隆,但是在KLF4-/-小鼠中這一數(shù)目降至15。 結(jié)論：KLF4敲除后表皮干細胞的數(shù)目減少,其自我更新能力下降,因此KLF4在表皮干細胞的維持中發(fā)揮著重要的角色。 第三部分小鼠皮膚急性創(chuàng)傷愈合過程中表達KLF4的表皮干細胞的作用 目的：研究表達KLF4的表皮干細胞對小鼠皮膚急性創(chuàng)傷愈合的作用。 方法：利用KLF4基因敲除小鼠模型,在小鼠背部用活檢穿孔器造成急性皮膚創(chuàng)傷,研究KLF4敲除是否影響小鼠皮膚急性創(chuàng)傷愈合過程；在KLF4/CreERTM/Rosa26RLacZ轉(zhuǎn)基因小鼠中,使用他莫昔芬誘導(dǎo)LacZ表達從而標(biāo)記表達KLF4的多潛能細胞,通過世系追蹤實驗在急性皮膚創(chuàng)傷愈合過程中研究KLF4+多潛能細胞是否參與皮膚愈合；同時建立體外KLF4穩(wěn)定敲除的人正常上皮HacaT細胞系,通過劃痕試驗進一步研究KLF4對創(chuàng)傷愈合的影響以及潛在的分子機制。 結(jié)果：創(chuàng)傷愈合實驗中,KLF4+/+小鼠背部傷口2天內(nèi)開始愈合,10天之后創(chuàng)面幾乎完全愈合。KLF4敲除使小鼠皮膚愈合過程明顯推遲,第10天仍有40%的創(chuàng)傷面積未愈合。世系追蹤試驗表明,給予他莫昔芬誘導(dǎo)的KLF4/CreERTM/Rosa26RLacZ小鼠創(chuàng)傷刺激后,在傷口邊緣能夠檢測到藍色的KLF4+多潛能細胞及其子代細胞向創(chuàng)面遷移。長期世系追蹤試驗顯示,他莫昔芬誘導(dǎo)八個月之后,小鼠完整的皮膚內(nèi)較難觀察到藍色的長期存活KLF4+表皮干細胞,但是給予創(chuàng)傷刺激后,傷口邊緣可以觀察到激活的KLF4+表皮干細胞以及其子代細胞。此外,體外實驗顯示細胞劃痕12小時后,對照組40%的劃痕面積愈合,而KLF4敲除組僅愈合12%,并伴隨著表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)的表達及磷酸化水平下降。 結(jié)論：表達KLF4的表皮干細胞參與小鼠皮膚急性創(chuàng)傷愈合過程。在HacaT細胞系中敲除KLF4,上皮細胞遷移減慢并伴隨EGFR表達下調(diào)。
[Abstract]:The expression of the first part KLF4 in mouse epidermal stem cells


Objective : To study the expression of KLF4 in mouse epidermal stem cells .


Methods : CD34 + CD49f + cells were isolated and purified using stem cell specific cell surface markers CD34 and CD49f . The expression of KLF4 was detected by real - time quantitative RT - PCR .


Results : The expression levels of KLF4 / EGFP and Sca - 1 + CD49f + cells in CD34 + CD49f + cells were higher than that in CD34 + CD49f + cells .


Conclusion : In combination with the above experimental results , we confirm that KLF4 is expressed in epidermal stem cells , and the epidermal stem cells expressing KLF4 have marker retention function and can proliferate and differentiate .
epidermal stem cells ;
Cell surface markers ;
Marker retention ;
descent tracking


Study on the function of the second part KLF4 in mouse epidermal stem cells


Objective : To study the function of KLF4 in mouse epidermal stem cells .


Methods : A mouse model of tamoxifen - induced KLF4 knockout mice was established .


Results : In KLF4 + / + mice , the percentage of CD34 + CD49f + hair follicle stem cells and Sca - 1 + CD49f + ife stem cells in KLF4 + / + mouse epidermal cells decreased to 6 . 26 % and 52 . 6 % , respectively .


Conclusion : KLF4 plays an important role in the maintenance of epidermal stem cells . KLF4 plays an important role in the maintenance of epidermal stem cells .


The role of KLF4 - expressing epidermal stem cells in the course of acute wound healing in the third part of mice


Objective : To study the effect of KLF4 - expressing epidermal stem cells ( KLF4 ) on acute wound healing in mice .


Methods : Using KLF4 knockout mice model , the acute skin trauma was induced by biopsy perforator on the back of mice .
In the KLF4 / CreERTM / Rosa26RAd transgenic mice , the multi - potential cells expressing KLF4 were identified by the use of tamoxifen - induced protein expression , and whether KLF4 + multi - potential cells were involved in skin healing were investigated in the course of acute skin wound healing .
At the same time , the human normal epithelial cells of human normal epithelial cells in vitro KLF4 were established , and the effects of KLF4 on wound healing and potential molecular mechanism were further investigated by scratch test .


Results : In the wound healing experiment , KLF4 + / + mice began to heal within 2 days after wound healing . After 10 days of wound healing , KLF4 + multi - potential cells and their progeny cells could not be observed .


Conclusion : The expression of KLF4 epidermal stem cells is involved in the healing process of acute wound healing in mice . KLF4 is knocked out in HHT T cell line , the migration of epithelial cells is slowed down and the expression of EGFR is downregulated .
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 石家仲;楊恬;雷明星;李進;邱偉明;連小華;;gasdermin3在小鼠同步化毛囊周期中的表達[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2011年05期

2 張志強;王玉杰;李佳;木拉提·熱夏提;;大鼠毛囊干細胞的成骨及成脂誘導(dǎo)[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報;2014年04期

3 張志強;王玉杰;木拉提·熱夏提;李佳;;角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基促進大鼠毛囊干細胞的增殖[J];中國組織工程研究;2013年45期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 賴向東;TNFR-1在小鼠毛囊周期中的表達及其作用初步探討[D];重慶大學(xué);2013年

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本文編號：2120048