本文選題：銅綠假單胞菌 + 斑點(diǎn)雜交�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：第一部分計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)聯(lián)合斑點(diǎn)雜交篩選銅綠假單胞菌PAO1motA基因反義寡核苷酸序列 目的:采用全基因?qū)ぐ屑夹g(shù)(full length gene targeting, FLGT)篩選能與銅綠假單胞菌PAO1motA基因的mRNA結(jié)合緊密的反義寡核苷酸序列。方法:采用計(jì)算機(jī)軟件(Mfold和RNA Structure 4.6)模擬銅綠假單胞菌PAO1motA基因mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),根據(jù)最小自由能原理設(shè)計(jì)出6條反義寡核苷酸探針序列,另設(shè)兩條陰性對(duì)照:一條為隨機(jī)設(shè)計(jì)的陰性對(duì)照序列,另一條為與motA基因上的一段堿基完全一樣的序列�？寺otA基因并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,同時(shí)用地高辛標(biāo)記motA mRNA,以斑點(diǎn)雜交方法篩選出與motA基因mRNA結(jié)合緊密、雜交信號(hào)較強(qiáng)的反義寡核苷酸序列。結(jié)果:PCR擴(kuò)增出motA基因的全長(852bp),斑點(diǎn)雜交顯示6條反義寡核苷酸中的4條顯示出雜交信號(hào)。結(jié)論:成功篩選到了能與motA mRNA牢固結(jié)合的反義序列,為進(jìn)一步研究以motA基因?yàn)榘械姆戳x技術(shù)抑制生物膜形成打下基礎(chǔ)。第二部分肽核酸體外抑制銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成的研究 目的:研究肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)對(duì)銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成的抑制作用,探討其潛在的抗銅綠假單胞菌生物膜形成的應(yīng)用價(jià)值。方法:根據(jù)第一部分篩選出的的反義寡核苷酸的序列合成肽核酸(PNA)并連接穿膜肽(cell penetrating peptide, CCPs) (KFF)3K形成CCPs-PNA,分別采用不同濃度的CCPs, PNA和CCPs-PNA處理銅綠假單胞菌PAO1,定量測定并用顯微鏡觀察其對(duì)生物膜形成的抑制作用,同時(shí)檢測其對(duì)motA基因表達(dá)的抑制作用以及對(duì)PAO1運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果:PNA和CCPs-PNA對(duì)銅綠假單胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用,并且隨著濃度的增加,其抑制作用也增加,但CCPs-PNA對(duì)生物膜形成的抑制明顯優(yōu)于PNA組。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA對(duì)PAO1生物膜形成的抑制率分別約為30%、50%、70%。而1μmol/L的PNA對(duì)PAO1生物膜的形成基本上沒有影響,5、10μmol/L的PNA對(duì)PAO1生物膜形成的抑制率卻分別為3%和10%左右。各個(gè)濃度的CCPs對(duì)細(xì)菌生物膜的形成基本上沒有影響。PNA和CCPs-PNA對(duì)motA基因的表達(dá)均有抑制作用,但CCPs-PNA的抑制明顯優(yōu)于PNA組。與對(duì)照組相比,CCPs-PNA處理之后的PAO1,其運(yùn)動(dòng)能力明顯下降,PAO1處理組與對(duì)照組在運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基上的擴(kuò)散直徑之比約為3:5。結(jié)論:針對(duì)motA基因的PNA通過抑制PAO1的運(yùn)動(dòng)能力、降低吸附從而對(duì)銅綠假單胞菌PA01起始階段的生物膜形成具有抑制作用,穿膜肽(KFF)_3K大大增強(qiáng)了此作用。推測銅綠假單胞菌的motA基因或其編碼產(chǎn)物可能是一個(gè)良好的抗銅綠假單胞菌生物膜形成的靶點(diǎn)。
[Abstract]:Part one screening of antisense oligonucleotide sequence of PAO1motA gene of Pseudomonas aeruginosa by computer-aided design combined with dot blot objective: to screen PAO1motA gene of Pseudomonas aeruginosa by (full length gene targeting, FLGT Its mRNA binds closely to the antisense oligonucleotide sequence. Methods: using computer software (Mfold and RNA structure 4.6) to simulate the secondary structure of PAO1motA gene mRNA in Pseudomonas aeruginosa, six antisense oligonucleotide probes were designed according to the principle of minimum free energy. Another two negative controls: one was a randomly designed negative control sequence and the other was a sequence identical to a sequence of bases on the motA gene. MotA gene was cloned and transcribed in vitro. At the same time, motA mRNAs were labeled with digoxigenin. The antisense oligonucleotide sequences with strong hybridization signal were screened by dot blot hybridization. Results the full length (852bp) of motA gene was amplified by motA and 4 of 6 antisense oligonucleotides were detected by dot blot hybridization. Conclusion: the antisense sequence which can bind to motA mRNA has been successfully screened, which lays a foundation for further research on the inhibition of biofilm formation by the antisense technique based on motA. The second part of the study on the inhibition of PAO1 biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa in vitro by peptide nucleic acid (PNA) objective: to study the inhibitory effect of PNA on PAO1 biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa in vitro. To explore the application value of its potential anti-Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Methods: according to the sequence of antisense oligodeoxynucleotides selected in the first part, synthetic peptide nucleic acid (PNA) was synthesized and ligated with transmembrane peptide (cell penetrating peptide, CCPs (KFF) 3K to form CCPs-PNA.The PAO1 of Pseudomonas aeruginosa was treated with different concentrations of CCPs, PNA and CCPs-PNA, respectively. The inhibition of biofilm formation was observed by microscope. At the same time, the inhibition of motA gene expression and its effect on PAO1 motor ability were detected. Results both of them inhibited the early formation of PAO1 biofilm of Pseudomonas aeruginosa, and with the increase of concentration, the inhibitory effects of PNA and CCPs-PNA were also increased. However, the inhibition of biofilm formation by CCPs-PNA was significantly higher than that by (KFF) 3K-PNA (KFF) 3K-PNA (10 渭 mol / L) in PNA group. The inhibitory rates of CCPs-PNA on PAO1 biofilm formation were about 3050g / 70g / L, respectively. However, 1 渭 mol / L PNA had no effect on the formation of PAO1 biofilm, but the inhibition rates of 10 渭 mol / L PNA on PAO1 biofilm formation were about 3% and 10%, respectively. Different concentrations of CCPs had no effect on the formation of bacterial biofilm. PNA and CCPs-PNA could inhibit the expression of motA gene, but the inhibition of CCPs-PNA was better than that of PNA group. Compared with the control group, the motor ability of PAO1 treated with CCPs-PNA was significantly decreased. The diffusive diameter ratio of PAO1 treatment group to control group was about 3: 5. Conclusion: PNAs targeting motA gene can inhibit the biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa PA01 at the initial stage by inhibiting the motor ability of PAO1 and reducing the adsorption, which is greatly enhanced by the transmembrane peptide (KFF) 3K. It is speculated that the motA gene or its encoding product of Pseudomonas aeruginosa may be a good target for the biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R440;R378.991

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本文編號(hào)：2112287