本文選題：虹鱒 + 漿母細(xì)胞��； 參考：《中國海洋大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：虹鱒作為硬骨魚,代表了免疫系統(tǒng)進(jìn)化史上的一個重要的階段,對其免疫系統(tǒng)的研究具有重要的意義。針對三硝基苯基-脂多糖(TNP-LPS,TL,T細(xì)胞非依賴性1型抗原),三硝基苯基-匙孔血藍(lán)蛋白(TNP-KLH,TK,T細(xì)胞依賴性抗原)以及三硝基苯基-匙孔血藍(lán)蛋白-脂多糖(TNP-KLH-LPS,TKL,嵌合抗原)免疫的虹鱒,對免疫后虹鱒的血液,脾臟和腎臟中的不同發(fā)育階段的抗原誘導(dǎo)的B細(xì)胞進(jìn)行了為期兩年的監(jiān)測。分析了ex vivo抗體分泌細(xì)胞,漿細(xì)胞,in vitro抗原可誘導(dǎo)B細(xì)胞的組織分布及動態(tài)變化。同時,虹鱒是世界上廣泛養(yǎng)殖的重要冷水魚,現(xiàn)在鮭鱒類養(yǎng)殖用的疫苗主要是革蘭氏陰性細(xì)菌苗,保護(hù)性免疫通常是菌苗和佐劑一起使用。但是這種疫苗劑型會影響其經(jīng)濟(jì)價值。若要制備更有效的對魚體無損害的疫苗,就必須明了其免疫系統(tǒng)的作用機制。本文通過比較這三種抗原的在細(xì)胞水平上的免疫效果,為設(shè)計更為行之有效的水產(chǎn)疫苗奠定基礎(chǔ)。 對免疫后的四組虹鱒(TL,TK,TKL,對照)在第0,6,16,25,35,44周取血,每組每次取3至10條,運用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)對抗體效價和抗體親和力進(jìn)行分析�？贵w效價結(jié)果表明,TL和TKL抗原的抗體反應(yīng)均在16周至25周之間出現(xiàn)峰值。TL和TKL顯示了快速而激烈的初次免疫應(yīng)答。TK抗原的初次應(yīng)答較為遲緩平穩(wěn)。TKL較TL反應(yīng)更快更高一些,顯示了嵌合抗原的優(yōu)勢。對親和力的研究顯示,這三種抗原均呈現(xiàn)出不同程度的親和力成熟。TK和TKL組與TL組相比具有較高的親和力,TKL的親和力最高,親和力成熟亦最為顯著,再次表明了嵌合抗原優(yōu)于TL和TK。 在免疫后的第0,6,16和44周解剖魚體,每組每次3至4條,分別取血,脾臟,前腎和后腎4種組織,收集組織中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行ex vivo和in vitro培養(yǎng),用細(xì)胞周期抑制劑羥基脲(HU)在in vitro培養(yǎng)過程中來區(qū)分漿母細(xì)胞(HU抑制其細(xì)胞周期)和漿細(xì)胞。淋巴細(xì)胞的in vitro可誘導(dǎo)能力是由在in vitro培養(yǎng)過程中加入特定濃度的TL抗原來誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞來確定的。而后采用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)定量組織中的抗體分泌細(xì)胞,觀察抗體分泌細(xì)胞(漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞)在各種組織中的分布情況。從ELISPOT結(jié)果來看,大量漿細(xì)胞(約85%)存在于虹鱒的前腎(相當(dāng)于哺乳動物的骨髓),而在血液,脾臟和后腎的均有較少的分布。漿母細(xì)胞和可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞(未成熟淋巴細(xì)胞和免疫記憶細(xì)胞)主要分布于外周血淋巴(72%)中,,在脾臟(14%)和前腎(16%)中的分布極少。對ex vivo的ELISPOT分析證明,自發(fā)的抗體分泌細(xì)胞主要存在于前腎中(86%)。后腎中可分離出來的白細(xì)胞數(shù)量很少,所以從總體來看其所含有的漿細(xì)胞,漿母細(xì)胞和可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞都比較少。針對三種不同的抗原,漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞以及未成熟淋巴細(xì)胞和記憶細(xì)胞的組織分布情況大致相同。就其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量而言,TKL顯示出了極大的優(yōu)勢,TK也同樣產(chǎn)生了很好的免疫反應(yīng)和免疫記憶。TL免疫后的白細(xì)胞,抗原誘導(dǎo)的in vitro反應(yīng),血細(xì)胞和脾細(xì)胞呈現(xiàn)出50到100倍的增加,而前腎中的白細(xì)胞僅增加了10倍。TD免疫后的白細(xì)胞, in vitro培養(yǎng)抗原誘導(dǎo)后,血細(xì)胞和脾細(xì)胞呈現(xiàn)出500倍的增加,而前腎中的白細(xì)胞僅增加了30倍。 第46周分別用TL和TK抗原二次免疫TL組和TK組來分析TI-1抗原和TD抗原在硬骨魚的產(chǎn)生免疫性記憶的能力。二次免疫后,分別在第16和46周取血,脾臟和前腎每組每次4尾,從抗體效價,抗體親和力以及產(chǎn)生抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量來看,這兩種抗原均可使魚體產(chǎn)生免疫性記憶。這與哺乳動物的只有對TD抗原才能產(chǎn)生免疫記憶的現(xiàn)象不同,虹鱒對TI-1抗原的二次免疫應(yīng)答要比TD抗原更快更激烈。 對不同時間點收集的淋巴細(xì)胞進(jìn)行HU定時(每24hr添加1次)添加實驗,來分析B細(xì)胞在硬骨魚主要免疫組織(血液,脾臟和前腎)中的的增殖分化情況。它可以確定三種細(xì)胞的量:1)處于分裂增殖狀態(tài)的抗體分泌細(xì)胞(如漿母細(xì)胞),2)誘導(dǎo)的可以過渡到早期漿細(xì)胞的漿母細(xì)胞(由HU敏感變?yōu)镠U不敏感),3)穩(wěn)定的漿細(xì)胞(HU不敏感)。結(jié)果表明,不管是在初次免疫后還是二次免疫后,血液中白細(xì)胞的in vitro反應(yīng)僅是由漿母細(xì)胞組成。而脾臟中,in vitro誘導(dǎo)的漿母細(xì)胞則可以分化為短壽漿細(xì)胞。與之相反的,免疫后16周前腎擁有一定數(shù)量的漿細(xì)胞。在前腎淋巴細(xì)胞的in vitro培養(yǎng)中添加TL抗原和HU對其幾乎沒有影響,它們在培養(yǎng)的初始就已經(jīng)出現(xiàn),并且一直存在于培養(yǎng)的過程中。這表明前腎中的大部分B淋巴細(xì)胞為B細(xì)胞分化的最終階段即漿細(xì)胞。 運用流式細(xì)胞儀分析各時間點包括第0,16,44,62,92周收集的主要免疫組織的B細(xì)胞的B細(xì)胞受體(BCR)親和力。與抗體的親和力成熟相似,各種組織的B淋巴細(xì)胞的BCR親和力亦隨著免疫時間呈現(xiàn)出親和力的成熟。
[Abstract]:Rainbow trout is an important stage in the evolution history of immune system , which represents an important stage in the evolution history of immune system .

Four groups of rainbow trout ( TL , TK , TKL , control ) were collected at 0 , 6 , 16 , 25 , 35 and 44 weeks . The antibody titer and antibody affinity were analyzed by enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) .

The cell cycle and cell cycle of lymphocytes were studied in vitro . The results showed that the number of cells in plasma cells , plasma cells and lymphocytes was very small .

The immune responses of TI - 1 and TD antigens were analyzed by using TL and TK antigen secondary immune TL and TK groups , respectively . After the secondary immunization , the immune memory of the fish body could be caused by the antibody titers , antibody affinity and the number of antibody - secreting cells in the 16 and 46 weeks .

The proliferation and differentiation of B - cells in the main immune tissues ( blood , spleen and prerenal ) were analyzed by adding TL antigens and HU to plasma cells ( HU - insensitive ) and stable plasma cells ( HU - insensitive ) .

B - cell receptor ( BCR ) affinity of B cells of primary immune tissues collected at each time point was analyzed by flow cytometry . The affinity maturation of B lymphocytes of various tissues was similar to that of antibody , and the BCR affinity of B lymphocytes of various tissues also showed affinity maturation with immune time .
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2103953