本文選題：氧化應激 + 磷酸化��； 參考：《東北林業(yè)大學》2012年碩士論文

【摘要】：氧化應激(oxidative stress)是指機體在遭受各種有害刺激時,體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與抗氧化防御之間嚴重失衡,氧化程度超出氧化物的清除,導致活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)在體內(nèi)蓄積而引起細胞毒性,從而導致組織損傷的過程。氧化應激是導致細胞損傷的最主要原因,并伴隨許多疾病(包括心血管疾病、自身免疫病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥及衰老等)的發(fā)生和發(fā)展。適量的ROS對細胞免疫應答非常關鍵,除在有絲分裂的應答過程中發(fā)揮作用,同時也參與了對抗感染原及一系列細胞信號轉導過程。但在某些病理情況下,ROS的水平超出了細胞的抗氧化能力,機體就會啟動氧化應答,通過一系列的抗氧化機制來維持體內(nèi)氧化還原的動態(tài)平衡,如抗氧化蛋白和修復蛋白的大量產(chǎn)生。如果這種平衡被打破,體內(nèi)自由基大量累積,同時機體的抗氧化防御能力下降,則會引發(fā)氧化應激,直接造成生物膜脂質過氧化、細胞內(nèi)蛋白及酶變性、DNA損傷,導致細胞死亡或凋亡及組織損傷,最終導致疾病的發(fā)生。因此,細胞內(nèi)的抗氧化酶類對于維持細胞內(nèi)這種氧化還原的動態(tài)平衡具有至關重要的作用。 過氧化物酶(Peroxiredoxins, Prxs)是生物體內(nèi)有著廣泛表達的抗氧化酶,通過催化H202和脂質氫過氧化物還原,避免細胞在氧化應激過程中受到進一步損傷。目前已知哺乳動物中至少存在六種Prx亞型(Prx Ⅰ～Ⅵ),根據(jù)參與催化反應的半胱氨酸殘基的數(shù)目和位置,可分為三個亞類：典型的2-Cys Prxs (Prx Ⅰ～Ⅳ),非典型的2-Cys Prx (Prx Ⅴ)和1-Cys Prx (PrxⅥ)。Prx1屬于典型的2-Cys Prxs,因為在其結構中有兩個具有氧化還原活性的半胱氨酸殘基。在催化反應過程中,氧化性的半胱氨酸(Cys-SH)殘基攻擊過氧化底物并將其還原,自身則被氧化為半胱氨酸次磺酸(Cys-SOH),然后與另一分子Prxl羧基末端還原性的半胱氨酸(Cys-SH)殘基反應,形成分子間二硫鍵。此時,Prx1可以在硫氧還蛋白(Thioredoxin, Trx),硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase, TrxR)和NADPH組成的還原系統(tǒng)下,重新被還原,高效地催化過氧化物還原,在氧化應激過程中發(fā)揮重要作用。 大量研究證實,Prx1不僅能以二聚體的形式存在,發(fā)揮過氧化物酶的作用,還可以十聚體的形式存在,充當分子伴侶的角色。這種結構上的變化賦予了Prx1功能上的多樣性,進而參與了體內(nèi)多種與氧化相關的細胞信號轉導通路的調(diào)節(jié),如第二信使H202介導的信號通路,凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)介導的信號通路,PTEN/AKT介導的信號通路,c-Jun氨基末端激酶(JNK)介導的信號通路,雄激素受體(AR)介導的信號通路以及p38/JNK應激活化蛋白激酶(SAPK)介導的信號通路等。因此,對Prx1功能的研究不僅有助于我們?nèi)娴卣J識其功能,而且對于多種相關疾病的診斷和治療具有重要意義。 隨著蛋白質組學研究的深入,我們逐漸認識到大量蛋白總是通過與其它蛋白分子發(fā)生相互作用或是通過一系列的翻譯后修飾過程(尤其是磷酸化)參與細胞的信號轉導過程。其中,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號轉導通路在維持細胞的正常生理功能,例如生長、發(fā)育、分化及凋亡中具有重要作用。一系列對真核細胞的研究表明,該通路在細胞應激反應中也起到關鍵作用。已知p38MAPK可以被多種刺激激活,如ROS、紫外線輻射、熱休克、細胞因子等,激活之后可以通過磷酸化不同的底物,例如一方面通過活化轉錄因子2(activating transcription factor-2,ATF2)、肌細胞增強因子2C(myocyte enhance factor2C, MEF2C)、活化轉錄因子如C/EBP同源蛋白(C/EBP homogolous protein, CHOP10)等來調(diào)節(jié)參與細胞反應的基因轉錄表達,另一方面還可激活胞內(nèi)的一些蛋白激酶如p38調(diào)節(jié)／激活蛋白激酶(p38regulated/activated protein kinase, PRAK)、MAPK激活蛋白激酶2/3(MAPK-activated protein kinase2/3, MK2/3)、MAPK相互作用激酶1/2(MAPK-interacting kinasel/2, MNK1/2)等來參與許多重要的生物學過程,包括細胞信號轉導、細胞骨架重構、應激和生長因子誘導的基因表達等。 生物體的生命活動與蛋白質的動態(tài)變化是密切相關的,很多情況下某些蛋白質的絕對量并不發(fā)生明顯的變化,而是通過各種翻譯后修飾來發(fā)揮生物學功能的。蛋白質的磷酸化修飾是非常重要的一種翻譯后修飾,最常發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸位點上,引起蛋白性質的變化、改變蛋白的定位、增強蛋白的靶向降解,或者影響蛋白與蛋白之間,蛋白與核酸之間的親和能力等,這些變化最終會導致許多生物過程的級聯(lián)放大,參與多種生物學過程。當前對蛋白磷酸化的研究絕大多數(shù)是基于電泳技術,利用抗磷酸化蛋白的抗體進行Western blot檢測,具有分辨率高、特異性好的優(yōu)點。但是,對于未知蛋白,在不知道具體磷酸化位點的情況下,由于磷酸化抗體的不特異,很難用該方法進行檢測。熒光雙向差異凝膠電泳(Fluorescent two di-mensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技術的出現(xiàn)為蛋白質組的研究提供了有力工具。蛋白磷酸化后會引起的等電點變化,在二維膠上發(fā)生水平遷移,表現(xiàn)為等電點不同的一串同源蛋白質點。挖取發(fā)生磷酸化遷移的蛋白點,利用一級質譜結合串聯(lián)質譜就可確定磷酸化位點。這一技術的出現(xiàn)和成熟,為蛋白質磷酸化修飾位點的鑒定提供了有力的工具。 在實驗室前期對PRAK的研究中發(fā)現(xiàn),受到外源性過氧化氫刺激時PRAK-/-細胞凋亡率明顯高于PRAK+/+細胞,表明PRAK蛋白在細胞發(fā)生氧化應激時可能扮演著重要的角色。為了進一步探討其作用機制,接下來用強氧化劑亞砷酸鈉分別刺激PRAK和PRAK+/+細胞,富集磷酸化蛋白,做雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)及質譜鑒定,發(fā)現(xiàn)在PRAK+/+細胞中,Prxl的磷酸化水平明顯升高,而在PRAK-/-細胞中,Prxl的磷酸化水平變化不大。同時有文獻報道,Prx1的過氧化物酶活性與其磷酸化水平有密切的關系。鑒于PRAK是MAPK信號通路下游的一個蛋白激酶,提示PRAK可能通過調(diào)控Prx1的磷酸化,從而調(diào)節(jié)Prxl的過氧化物酶活性,參與細胞氧化應激反應。因此本實驗旨在利用免疫印跡結合2D-DIGE技術鑒定氧化應激過程中PRAK對Prx1磷酸化水平的影響,并通過由酵母硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)、酵母硫氧還蛋白還原(thioredoxin reductase, TrxR)和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)組成的yTrx活性檢測系統(tǒng)考察磷酸化修飾對Prx1過氧化物氧化還原酶活性的影響,進而揭示細胞氧化應激過程中PRAK對Prxl的調(diào)控機制。 通過本課題研究,我們得出以下結論： 1.成功構建了pET14b-Prx1重組質粒并進行原核表達純化,獲得了His-Prxl蛋白。 2.進行體外激酶反應,用Western Blot技術對Prxl體外的磷酸化水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)PRAK對Prx1的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基都沒有明顯的磷酸化現(xiàn)象。結合2D-DIGE技術對Prxl的磷酸化水平進行檢測,沒有發(fā)現(xiàn)明顯的pI差異蛋白點,提示PRAK對Prxl可能沒有直接的磷酸化調(diào)節(jié)作用。 3.培養(yǎng)PRAK-/-、PRAK+/+細胞,分別給予NaAsO2刺激45min后裂解細胞獲取蛋白,進行Western Blot檢測,結果發(fā)現(xiàn)PRAK-/-、PRAK+/+細胞中Prxl的蘇氨酸位點均未發(fā)生明顯磷酸化；PRAK-/-細胞中Prx1絲氨酸位點存在著一定水平的磷酸化,但其水平低于PRAK+/+細胞中Prx1絲氨酸水平,提示PRAK的存在對Prxl的絲氨酸磷酸化有促進作用,但該作用是否受到氧化應激條件的影響,尚不明確。PRAK-/-細胞中Prxl酪氨酸位點未發(fā)生明顯磷酸化,而PRAK+/+細胞Prxl酪氨酸位點發(fā)生明顯磷酸化,并且其酪氨酸磷酸化水平在受到氧化刺激后有所增強。提示PRAK的存在對Prx1的酪氨酸磷酸化水平亦有影響,且與氧化刺激過程相關聯(lián)。 4.提取酵母細胞基因組,成功構建了pET14b-yTrx1P、ET14b-yTrxR重組質粒,并原核表達純化獲得His-yTrx1、His-yTrxR蛋白。 5.優(yōu)化yTrx活性檢測系統(tǒng)的反應條件,并對純化的Prx1的過氧化物酶活性進行了檢測,證明成功建立了該活性檢測系統(tǒng)。 6.利用yTrx活性檢測系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)PRAK+/+比PRAK-/-細胞內(nèi)Prxl的過氧化物酶活性要強,而當受到強氧化劑NaAsO2刺激后,Prxl的活性降低。提示：PRAK可能是通過調(diào)控Prx1的磷酸化水平,從而調(diào)節(jié)Prx1的過氧化物酶活性,造成H202等第二信使分子的瞬時累積,啟動其下游細胞信號通路,進而參與細胞氧化應激反應。
[Abstract]:Oxidative stress refers to the serious imbalance between the generation of free radicals in the body and the anti - oxidation defense when the organism is subjected to various harmful stimuli . The oxidation degree exceeds the oxidation resistance of the cells .

In the process of catalytic reaction , there are at least six Prx isoforms ( Prx 鈪，

本文編號：2103291