本文選題：HEK-293 + Twist�。� 參考：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：目的：采用細(xì)胞劃痕、CCk-8、RT-PCR、Western Blot等技術(shù)對(duì)照觀察Twist穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人腎上皮細(xì)胞株HEK-293-Twist和空載體轉(zhuǎn)染的HEK-293-vector細(xì)胞株的遷移能力、對(duì)腫瘤化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)、曲古菌素A(TSA)、紫杉醇(Taxol)的敏感性以及Twist、 NF-κB、Akt、FHIT基因表達(dá)的差異性,初步探討Twist在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥中的作用及可能存在的分子作用機(jī)制。方法：(1)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)期HEK-293-Twist和HEK-293-vector細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù),用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml,接種單細(xì)胞懸液于六孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí),換正常培養(yǎng)基為無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,待細(xì)胞貼壁率達(dá)90%以上時(shí),用無菌槍頭在每個(gè)孔中長(zhǎng)滿的單層細(xì)胞上迅速而輕輕地劃1-2道痕,間距0.5～1cm,1×PBS沖洗掉脫落的細(xì)胞,繼續(xù)在37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別在0、7、24h時(shí)間點(diǎn)拍照觀察,比較不同細(xì)胞劃痕修復(fù)速度。(2)Cell Counting Kit-8:調(diào)整對(duì)數(shù)期HEK-293-Twist和HEK-293-vector細(xì)胞密度為1×104/ml,按每孔100μl接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后每種細(xì)胞分為不同濃度TSA組(1、4、8μmol/L).5-Fu組(2.5、12.5、62.5、312.5μol/L)、Taxol組(0.276、1.38、6.9、34.5μmol/L)、對(duì)照組(不加藥物)和空白組(只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞),每組6復(fù)孔,培養(yǎng)24h后每孔加入10μl CCK-8,繼續(xù)孵育3h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以450nm為檢測(cè)波長(zhǎng),630nm為參考波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度值(A)。(3)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR)方法：采用Trizol法,按照總RNA提取試劑盒說明提取HEK-293-Twist、HEK-293-vector,總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,PCR擴(kuò)增Twist、FHIT基因,凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,相應(yīng)軟件分析結(jié)果,探討細(xì)胞中Twist與FHIT表達(dá)的相關(guān)性(4) Western Blot法檢測(cè)Twist、NF-κB、Akt、FHIT蛋白的表達(dá)：用RIPA裂解液提取HEK-293-Twist、HEK-293-vector細(xì)胞和加藥處理后的細(xì)胞總蛋白,考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白濃度后按每孔40μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉封閉1h,棄封閉液分別加入Twist、NF-κB、Akt、FHIT一抗作用2h,再與HRP標(biāo)記的二抗室溫振搖孵育1h,于暗室中曝光顯影,凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行灰度掃描并運(yùn)用Quantity one軟件對(duì)得到的圖像進(jìn)行條帶灰度分析,計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參灰度比值。結(jié)果：(1)細(xì)胞劃痕現(xiàn)象：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),兩種細(xì)胞株均出現(xiàn)明顯向劃痕處的遷移,但速度不同,7h時(shí),兩種細(xì)胞株的遷移比較無明顯差異,24h時(shí),HEK-293-Twist細(xì)胞株劃痕已近彌合,而HEK-293-vector細(xì)胞株與7h時(shí)相比,劃痕變化不明顯。(2)不同化療藥處理后,CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,TSA、5-Fu、Taxol對(duì)HEK-293-Twist、HEK-293-vector兩種細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用,其中低濃度的TSA和5-Fu對(duì)兩種細(xì)胞的抑制作用不明顯,隨著濃度的增高出現(xiàn)一定程度的增效作用,Taxol則在低濃度便出現(xiàn)明顯的抑制作用,并且HEK-293-Twist細(xì)胞株對(duì)三種化療藥物的敏感性明顯弱于HEK-293-vector細(xì)胞株(p0.05)。(3)RT-PCR結(jié)果顯示：Twist在HEK-293-vector細(xì)胞株中僅有微弱表達(dá),在HEK-293-Twist中表達(dá)明顯(p0.05)；FHIT在HEK-293-Twist和HEK-293-vector細(xì)胞株中均有基礎(chǔ)性表達(dá),但在前者的表達(dá)量明顯低于后者(p0.05)。(4)從WB結(jié)果可見：在HEK-293-Twist細(xì)胞株中Twist高表達(dá),NF-κB、Akt的表達(dá)也明顯強(qiáng)于HEK-293-vector細(xì)胞株中的表達(dá),而FHIT的表達(dá)弱于HEK-293-vector細(xì)胞中的表達(dá),在HEK-293-vector中Twist無表達(dá)；在TSA、Taxol和5-Fu處理組HEK-293-Twist細(xì)胞株中Twist、NF-kB. Akt的表達(dá)均明顯高于HEK-293-vector細(xì)胞中的表達(dá),FHIT的表達(dá)也明顯高于HEK-293-Vector細(xì)胞中的表達(dá),隨著藥物作用濃度的增高,Twist與Akt、NF-kB表達(dá)的變化趨勢(shì)相同(p0.05),而FHIT則與Twist表達(dá)的變化趨勢(shì)相反(p0.05)。結(jié)論：1.在HEK-293細(xì)胞中,Twist可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移,提高細(xì)胞對(duì)化療藥物TSA、5-Fu、Taxol的抵抗性。2. HEK-293-Twist細(xì)胞中Twist的表達(dá)可能與NF-κB、Akt的表達(dá)存在正相調(diào)節(jié),與FHIT的表達(dá)存在負(fù)相調(diào)節(jié),提示NF-κB、Akt、 FHIT與Twist的表達(dá)存在一定的相關(guān)性,這可能參與了Twist促進(jìn)細(xì)胞多藥耐藥形成的作用機(jī)制。
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本文編號(hào)：2095483