本文選題：肝再生 + 陷窩細(xì)胞��； 參考：《河南師范大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：肝臟是人體的重要器官之一,其強(qiáng)大的再生能力亦為學(xué)者重視。人們通常以Higgins和Anderson建立的大鼠2/3肝切除手術(shù)誘導(dǎo)的再生肝組織材料為對象研究肝再生分子機(jī)理。但肝臟由多種細(xì)胞組成,肝再生中各種肝臟細(xì)胞的生理、生化活動顯著不同,肝再生進(jìn)程一般受到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的信號協(xié)調(diào)支配。因此將再生肝的各種細(xì)胞分離出來分別進(jìn)行研究,將會使研究結(jié)果更加明晰、簡化。陷窩細(xì)胞(pit cell)是肝臟特異的自然殺傷細(xì)胞,不僅對腫瘤細(xì)胞和病毒感染的肝細(xì)胞有直接殺傷作用,還參與調(diào)控肝再生的程度。盡管關(guān)于陷窩細(xì)胞在肝臟重建方面的功能有所闡述,但目前缺乏轉(zhuǎn)錄水平上深入研究陷窩細(xì)胞與肝再生的具體關(guān)系的研究。 為從基因轉(zhuǎn)錄水平系統(tǒng)研究陷窩細(xì)胞在肝再生中作用,本研究按Higgins等方法制作大鼠部分肝切除(partial hepatectomy,PH)模型,用兩步灌流法分散肝臟細(xì)胞,用60%的percoll密度梯度離心和免疫磁珠分離肝陷窩細(xì)胞,用real-time RT-PCR定量陷窩細(xì)胞的CD8和CD56 mRNA,用蛋白免疫印跡方法定量陷窩細(xì)胞的CD8和CD56蛋白。初步證實(shí),從PH后各時(shí)間點(diǎn)分離的肝陷窩細(xì)胞成活率均在96%以上,CD8和CD56陽性細(xì)胞占95%以上,CD8和CD56 mRNA量穩(wěn)定,相應(yīng)的蛋白量亦穩(wěn)定。 本文接著從分離得到的高活性、高純度的陷窩細(xì)胞入手,用含11789個(gè)已知基因、13231個(gè)未知基因的Rat Genome 230 2.0芯片首次檢測大鼠2/3肝切除后恢復(fù)10個(gè)時(shí)點(diǎn)的肝陷窩細(xì)胞基因表達(dá)譜,用real-time PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性,用生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)方法分析它們與大鼠肝再生的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),共970個(gè)基因(包括612個(gè)已知基因和358個(gè)未知基因)與大鼠肝再生相關(guān)。聚類分析顯示上述612個(gè)已知基因明顯呈現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)兩種表達(dá)模式,k-means按照它們在肝再生中的表達(dá)異同細(xì)分為Cluster 1-8。GO分析顯示上調(diào)基因和下調(diào)基因均主要涉及23種生理活動。根據(jù)大鼠再生肝陷窩細(xì)胞的基因表達(dá)模式和功能富集分析,發(fā)現(xiàn)陷窩細(xì)胞中的細(xì)胞因子、生長因子等活性物質(zhì)的分泌及其參與的信號級聯(lián)反應(yīng)在肝再生啟動階段增強(qiáng),肝陷窩細(xì)胞增殖主要在24-72h之間,免疫、炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄及效應(yīng)發(fā)揮主要發(fā)生在肝再生終止階段,而陷窩細(xì)胞顯然不承擔(dān)創(chuàng)傷愈合和基礎(chǔ)物質(zhì)代謝的功能角色。 其中,骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種活化淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的活性細(xì)胞因子,它的mRNA水平在2-72h再生肝陷窩細(xì)胞中顯著上調(diào),最高達(dá)是對照的31倍。應(yīng)用Pathway Studio 7.0分析、建立陷窩細(xì)胞中肝再生相關(guān)基因之間的互作關(guān)系網(wǎng)發(fā)現(xiàn),與OPN有關(guān)聯(lián)的蛋白多達(dá)30多個(gè),包括調(diào)節(jié)蛋白和靶蛋白,多種炎性疾病的發(fā)生與此基因互作網(wǎng)相關(guān)。說明OPN與再生肝的陷窩細(xì)胞密切相關(guān)。 為闡明OPN對肝再生的影響,本研究克隆了opn基因,并構(gòu)建了opn的表達(dá)載體pEGFP-N1-opn及其干涉載體pGenesil-1.0-opn(313)和pGenesil-1.0-opn(887),在此基礎(chǔ)上繼續(xù)構(gòu)建了干涉載體對應(yīng)的檢驗(yàn)載體pGenesil-1.0-HK-opn、pGenesil-1.0-opn(313)-opn和pGenesil-1.0-opn(887)-opn。將各檢驗(yàn)載體分別進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因,根據(jù)與OPN融合表達(dá)的綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率與對照相比的下降程度,判斷pGenesil-1.0-opn(313)比pGenesil-1.0-opn(887)的干涉效果強(qiáng)烈。將表達(dá)載體和干涉載體分別進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因得出外源性基因或干涉片段的表達(dá)高峰時(shí)點(diǎn),結(jié)合內(nèi)源性opn在大鼠再生肝組織中PH后6-12h表達(dá)最高,依據(jù)使內(nèi)源性和外源性opn的作用疊加的原則,選擇于PH前30h轉(zhuǎn)入表達(dá)載體,PH后0h轉(zhuǎn)入干涉載體。通過對大鼠死亡率、表達(dá)動力學(xué)、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、再生肝指數(shù)、肝再生率等方面的結(jié)果分析表明:轉(zhuǎn)入opn表達(dá)載體后,炎癥反應(yīng)和肝損傷明顯加劇。相反,干涉質(zhì)粒pGenesil-1.0-opn(313)能顯著降低肝系數(shù)和肝再生率,減少pcna, myc, bcl2, icam1, mmp2和tgfb1的表達(dá)量。綜上所述,opn是肝再生相關(guān)基因,可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成而發(fā)揮增強(qiáng)肝再生作用。
[Abstract]:The liver is one of the most important organs of human body , and its powerful regeneration ability is also paid attention to by scholars . The liver regeneration process is usually controlled by the regeneration of liver tissue material induced by 2 / 3 hepatectomy in rats .

In order to study the role of lacunae cells in liver regeneration from gene transcription level system , the partial hepatectomy ( PH ) model was prepared by two - step perfusion method . CD8 and CD56 proteins were quantified by using a two - step perfusion method . The survival rates of CD8 and CD56 were quantified by means of a real - time RT - PCR method . The survival rates of CD8 and CD56 were more than 96 % , CD8 and CD56 positive cells were more than 95 % , and the amount of CD8 and CD56 mRNA was stable .

The results showed that 970 genes ( including 612 known genes and 358 unknown genes ) were associated with liver regeneration in rats . The results showed that 970 genes ( including 612 known genes and 358 unknown genes ) were associated with liver regeneration in rats .

In this study , osteolytic and osteolytic activity is an active cytokine secreted by activated lymphocytes and macrophages , and its mRNA level is up - regulated in 2 - 72 h of regenerated liver - trapping cells , up to 31 - fold higher than that of control .

The expression vector pGenesil - 1.0 - HK - opn , pGenesil - 1.0 - opn ( 313 ) - opn , pGenesil - 1.0 - opn ( 887 ) - opn ( pGenesil - 1.0 - opn ( 887 ) - opn ( pGenesil - 1.0 - opn ( 887 ) - opn was constructed .
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王在國，丁福全，陳利華，劉光中;罕見肝再生腫塊誤診為肝癌肺轉(zhuǎn)移一例[J];四川腫瘤防治;1995年01期

2 王在國，丁福全，陳利華，劉光中;罕見肝再生腫塊誤診為肝癌肺轉(zhuǎn)移一例[J];中國腫瘤臨床與康復(fù);1995年04期

3 繆明永,蔡在龍,劉鵬飛,王學(xué)敏,毛積芳,陳克明;大鼠肝再生過程中線粒體氧化磷酸化的調(diào)控[J];中國病理生理雜志;1999年05期

4 李國欽;肝細(xì)胞生長因子能否刺激肝再生的研究[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2000年02期

5 焦華波;黃志強(qiáng);姚詠明;;肝再生研究中膽汁淤積性實(shí)驗(yàn)動物模型進(jìn)展[J];中國急救復(fù)蘇與災(zāi)害醫(yī)學(xué)雜志;2008年03期

6 楊懷滔;榮成;陳智芳;張曉;李可洲;;肝細(xì)胞生長因子(HGF)對肝再生的影響[J];科技信息;2009年26期

7 戚心廣;日本對肝細(xì)胞保護(hù)與肝再生的研究[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;1989年03期

8 鄒原，宮德正，崔秀云，梅懋華;肝再生的調(diào)控及原癌基因表達(dá)[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1996年01期

9 張紅衛(wèi),區(qū)慶嘉,陳雙,蔣寧一;肝硬變大鼠肝大部分切除后肝再生的實(shí)驗(yàn)研究[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志;1997年02期

10 許望翔,汪思應(yīng),魏漢東,楊曉明;用RDA技術(shù)尋找肝再生相關(guān)基因的初步研究[J];生理學(xué)報(bào);2000年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張修國;馮寶珍;王和美;;辣椒疫霉菌效應(yīng)蛋白NPP基因家族致病遺傳機(jī)制及其功能分析[A];中國菌物學(xué)會第五屆會員代表大會暨2011年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

2 柏樺;劉瑞;陳宏莉;秦緒軍;梁欣;海春旭;;ROS調(diào)控正常肝細(xì)胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變的信號作用及機(jī)制研究[A];中國活性氧生物學(xué)效應(yīng)學(xué)術(shù)會議論文集（第一冊）[C];2011年

3 李文學(xué);劉剛;柴春利;魯成;;家蠶mago nashi基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)研究[A];中國蠶學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)研討會論文集（1）[C];2009年

4 代雪梅;劉淑丹;李紅麗;肖嵐;;極限門靜脈結(jié)扎肝細(xì)胞中IL-6的表達(dá)與肝增殖作用的研究[A];中國解剖學(xué)會2011年年會論文文摘匯編[C];2011年

5 毛德文;呂建林;張榮臻;王明剛;邱華;龍富立;;大黃、赤芍對術(shù)后肝衰竭大鼠肝細(xì)胞再生指標(biāo)的影響[A];第二十次全國中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

6 吳昊;海春旭;;川芎嗪對肝切除大鼠肝細(xì)胞再生的促進(jìn)作用[A];中國活性氧生物學(xué)效應(yīng)學(xué)術(shù)會議論文集（第一冊）[C];2011年

7 郝香芬;曾小明;夏機(jī)良;顏孫興;劉曉明;彭白露;;食蟹猴糖尿病模型不同時(shí)期相關(guān)基因表達(dá)模式[A];第九屆中國實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)年會（2010新疆）論文集[C];2010年

8 劉思德;;生物人工肝研究進(jìn)展[A];肝臟病防治學(xué)術(shù)研討會及新進(jìn)展學(xué)習(xí)班�？痆C];2005年

9 張志;單毓強(qiáng);高毅;潘明新;;供肝受體化誘導(dǎo)肝移植大鼠長期存活[A];肝臟病防治學(xué)術(shù)研討會及新進(jìn)展學(xué)習(xí)班�？痆C];2005年

10 高毅;慕寧;唐力軍;;體外誘導(dǎo)人骨髓多能成體祖細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];肝臟病防治學(xué)術(shù)研討會及新進(jìn)展學(xué)習(xí)班�？痆C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 陳漢橋;大連醫(yī)大肝再生研究取得進(jìn)展[N];中國醫(yī)藥報(bào);2007年

2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科主任 陳鐘;急性肝衰竭的肝細(xì)胞移植[N];健康報(bào);2007年

3 李瀚e，

本文編號：2092643