發(fā)布時(shí)間：2018-06-28 08:16

  本文選題：α1-抗胰蛋白酶 + 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞��； 參考：《暨南大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：目的：研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）移植后仍存在免疫原性，為解決iPSCs及其誘導(dǎo)分化的胰島素分泌細(xì)胞（insulin-producingcells，IPCs）在治療糖尿病過程中出現(xiàn)的免疫排斥問題，本研究在構(gòu)建小鼠iPSCs基礎(chǔ)上，導(dǎo)入人α1-抗胰蛋白酶（Alpha1-antitrypsin，AAT）基因建立iPSCs-hAAT系。隨后將小鼠iPSCs和iPSCs-hAAT誘導(dǎo)分化為IPCs。觀察hAAT對iPSCs免疫原性的影響，以及IPCs在同種異體移植治療糖尿病小鼠時(shí)，hAAT對IPCs免疫保護(hù)性作用。 方法：①小鼠iPSCs的建立：用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對plat-E細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝，用含有Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒上清感染C57（Oct4-GFP）小鼠MEFs，將其重編程為小鼠iPSCs，，并進(jìn)行相關(guān)鑒定。②hAAT對小鼠iPSCs的免疫保護(hù)作用：用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將hAAT基因?qū)胄∈骾PSCs，通過G418篩選得到抗性克隆，經(jīng)WesternBlot進(jìn)行鑒定，獲得穩(wěn)定表達(dá)hAAT的小鼠iPSCs-hATT。通過CTL實(shí)驗(yàn)，ELISA法和RT-PCR檢測炎性因子的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，觀察hAAT對小鼠iPSCs免疫原性的影響。③小鼠iPSCs誘導(dǎo)分化為IPCs：將iPSCs和iPSCs-hATT兩種細(xì)胞，在體外通過添加RA、ActivinA、N2、B27、bFGF、HGF和nicotinamide等物質(zhì)誘導(dǎo)分化為IPCs，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，細(xì)胞免疫熒光法，RT-PCR法和葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行鑒定。④hAAT在同種異體細(xì)胞移植治療糖尿病小鼠過程中對iPSCs來源的IPCs的免疫保護(hù)作用：將iPSCs和iPSCs-hATT來源的IPCs移植到BALB/c糖尿病小鼠的左腎包膜下。檢測移植后血糖變化、血清胰島素水平、葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)、移植部位病理學(xué)變化，觀察hAAT在糖尿病治療中對IPCs的免疫保護(hù)性作用。 結(jié)果：①誘導(dǎo)獲得的小鼠iPSCs細(xì)胞形態(tài)與小鼠ESCs相似，堿性磷酸酶染色呈現(xiàn)深紫紅色，陽性率在90%以上。能夠表達(dá)小鼠ESCs的一些干性基因和蛋白，包括SSEA-1、Nanog和Oct4。將小鼠iPSCs移植到裸鼠的腹股溝，能夠形成具有3個(gè)胚層分化能力的畸胎瘤。②轉(zhuǎn)染hAAT基因后，經(jīng)G418篩選，獲得的iPSCs-hAAT細(xì)胞，經(jīng)Western Blot檢測可穩(wěn)定表達(dá)hAAT蛋白。將iPSCs和iPSCs-hAAT分別與同種異體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，iPSCs-hAAT組較IPCs組淋巴細(xì)胞IL-4的分泌量明顯增高（P0.05），IFN-γ的分泌量明顯降低（P0.05）。CTL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，iPSCs-hAAT組細(xì)胞凋亡率明顯低于iPSCs組（P0.05）。RT-PCR檢測炎性因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)iPSCs-hAAT組細(xì)胞CRP表達(dá)量較iPSCs組明顯升高，IL-1β和IL-6表達(dá)較iPSCs組明顯降低。③在三步法誘導(dǎo)分化為IPCs過程中，iPSCs狀態(tài)發(fā)生了改變，從貼壁生長狀態(tài)成為懸浮生長狀態(tài)，形成典型的擬胚體。隨后在1%Matrigel培養(yǎng)皿中細(xì)胞向四周緩慢展開，形成類似細(xì)胞團(tuán)樣的結(jié)構(gòu)。RT-PCR檢測兩種來源的IPCs均表達(dá)PDX1和Insulin基因。免疫熒光檢測IPCs表達(dá)PDX1，Insulin和NKX6.1陽性蛋白。葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)，IPCs能夠分泌胰島素和C肽。④iPSCs和iPSCs-hATT來源的IPCs移植治療糖尿病小鼠，移植后第3天開始均可使血糖降至正常小鼠血糖水平，與iPSCs來源的IPCs組相比，iPSCs-hAAT來源IPCs組小鼠維持正常血糖水平時(shí)間明顯延長，小鼠血清胰島素水平較高。糖耐量實(shí)驗(yàn)，iPSCs-hAAT來源IPCs組小鼠具有更好的血糖調(diào)控能力。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，移植后第14天，來源于小鼠iPSCs-hAAT的IPCs移植組，移植部位結(jié)構(gòu)正常，炎癥反應(yīng)很弱，有極少量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤。來源于小鼠iPSCs的IPCs移植組，移植部位出現(xiàn)較明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。移植28天后，小鼠iPSCs來源的IPCs移植組，移植部位炎癥反應(yīng)的范圍加大，炎癥細(xì)胞浸潤的情況加重。小鼠iPSCs-hAAT來源的IPCs移植組出現(xiàn)了一定范圍的炎癥反應(yīng)，但相比之下，其炎癥細(xì)胞浸潤的情況明顯較輕。 結(jié)論：①通過體細(xì)胞重編程技術(shù)成功構(gòu)建得到了小鼠iPSCs。②獲得穩(wěn)定表達(dá)hAAT蛋白的小鼠iPSCs-hAAT。hAAT通過抑制炎癥因子的表達(dá)，抗凋亡發(fā)揮對iPSCs的免疫保護(hù)作用。③將小鼠iPSCs和iPSCs-hAAT誘導(dǎo)分化為有功能的IPCs。④iPSCs-hAAT來源的IPCs移植治療糖尿病小鼠，hAAT對移植的IPCs具有一定免疫抑制作用，可有效延長IPCs存活時(shí)間，從而發(fā)揮胰島β細(xì)胞治療糖尿病的效果。
[Abstract]:Objective : To investigate the immunogenicity of induction pluripotent stem cells ( iPSCs ) after transplantation . In order to solve the problem of immune rejection in the treatment of diabetes mellitus , the induction of the expression of human 偽 1 - antitrypsin ( APCs ) in the treatment of diabetes mellitus was investigated . The effect of hAT on the immunogenicity of iPSCs was observed and the protective effect of hAPCs on IPCs was observed when the mice were treated with allotransplantation .

Methods : 鈶

本文編號：2077336