發(fā)布時間：2018-06-27 03:38

  本文選題：血管緊張素Ⅱ + 離子通道��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)對維持心血管系統(tǒng)正常生理功能發(fā)揮重要作用,但該系統(tǒng)功能的失調(diào)參與高血壓、心力衰竭、動脈粥樣硬化等許多心血管疾病的發(fā)生,具有重要的病理生理意義。近年,大量的臨床報道表明,減少血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生的血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI)和AngⅡ的Ⅰ型受體AT_1受體拮抗劑可明顯降低心衰病人心律失常所致的心性猝死(Sudden cardiac death, SCD)危險性,成為目前臨床治療高血壓、心衰的重要藥物。然而,RAS潛在致心律失常的機(jī)制尚不清楚。選擇性心肌組織過表達(dá)AngⅡ基因或AT1受體的小鼠出現(xiàn)明顯復(fù)極化延遲,伴高發(fā)的室性心律失常,年幼的轉(zhuǎn)基因動物在不存在組織肥厚性重構(gòu)情況下就伴高發(fā)的心律失常,提示AngⅡ可能通過直接調(diào)控心肌離子通道參與病理情況下心律失常的產(chǎn)生。但目前AngⅡ?qū)π募‰娚砘顒拥闹苯诱{(diào)控作用了解極少,我們的總體目標(biāo)是研究AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞電活動的直接影響,以揭示病理情況下心律失常的產(chǎn)生機(jī)制。在前期的研究中我們業(yè)已發(fā)現(xiàn),AngⅡ可以抑制豚鼠心室肌細(xì)胞的快激活延遲整流鉀電流(Ikr)、延遲動作電位復(fù)極過程。 竇房結(jié)是心臟自律性發(fā)源地,其起搏功能對維持心臟正常的泵血功能至關(guān)重要。慢性心衰病人常常伴有明顯竇房結(jié)電生理重構(gòu),導(dǎo)致其儲備功能降低,有資料顯示,由此形成的緩慢型心律失常造成的SCD可高達(dá)住院病人SCD的42%。因此,了解竇房結(jié)自律性產(chǎn)生機(jī)制及其調(diào)節(jié)具有重要意義。半個世紀(jì)以來普遍認(rèn)為心臟節(jié)律開始于竇房結(jié)起搏細(xì)胞膜表面各種電壓依賴的離子通道,起搏細(xì)胞動作電位的產(chǎn)生正是這些離子通道共同作用的結(jié)果。由于膜離子通道的開放與關(guān)閉受膜電位的影響,因此該過程又稱為膜鐘(membrane clocks)。近年有人提出,細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)釋放是竇房結(jié)自律性產(chǎn)生的另外一個機(jī)制,即在竇房結(jié)起搏細(xì)胞中,細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)([Ca~(2+)]_(in))的循環(huán)誘導(dǎo)了membrane clocks的發(fā)生,構(gòu)成了自動去極化的重要起因,人們將這一機(jī)制稱為鈣鐘(Ca~(2+) clock)。迄今為止,關(guān)于AngⅡ?qū)Ω]房結(jié)細(xì)胞自律性及其對上述膜鐘、鈣鐘的影響報道較少且不一致。KCNA5基因編碼的Kv1.5通道蛋白構(gòu)成了心房細(xì)胞超速激活的外向整流鉀電流(I_(kur))通道,為心房細(xì)胞特有的鉀通道,在心房細(xì)胞動作電位復(fù)極過程中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于AngⅡ?qū)v1.5通道的直接調(diào)控作用尚不清楚。 本實(shí)驗(yàn)利用全細(xì)胞膜片鉗電生理記錄技術(shù),在急性分離的豚鼠竇房結(jié)細(xì)胞觀察了AngⅡ?qū)Ω]房結(jié)自發(fā)起搏頻率的影響,并分析了對膜鐘、鈣鐘的調(diào)控;在表達(dá)Kv1.5的人胚胎腎細(xì)胞(HEK_293)上,觀察AngⅡ?qū)Kv1.5的直接調(diào)控作用,并初步分析其作用機(jī)制。以其為全面了解AngⅡ的心肌電生理效應(yīng)提供試驗(yàn)依據(jù)。 第一部分AngⅡ?qū)﹄嗍蟾]房結(jié)細(xì)胞的電生理影響 目的:觀察AngⅡ?qū)﹄嗍蟾]房結(jié)細(xì)胞自發(fā)起搏頻率及膜離子通道電流的影響 方法:在急性分離的豚鼠竇房結(jié)細(xì)胞,常規(guī)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄并觀察AngⅡ?qū)Ω]房結(jié)動作電位(AP)、超極化激活起搏電流I_f、延遲整流鉀電流慢成份I_(ks)及L型鈣電流I_(CaL)影響。 用于竇房結(jié)細(xì)胞自發(fā)動作電位記錄的細(xì)胞外液組成(in mM):NaCl 138, KCl 4, MgCl_2 1, CaCl_2 2, NaH_2PO_4 0.33, glucose 10,和HEPES 10 (用NaOH調(diào)pH至7.4).;電極內(nèi)液成分包括(in mM): KCl 140, MgCl_2 5, K_2ATP 1,和HEPES 3 (用KOH調(diào)pH至7.2),電極內(nèi)液中加入兩性霉素B (240μg/ml)。 記錄I_f的細(xì)胞外液為(in mM):NaCl 132, KCl 4, MgCl_2 1.2, CaCl_2 1.8, glucose 5, and HEPES, 10 (用NaOH調(diào)pH至7.4);電極內(nèi)液成份為(in mM) :KCl 150, K_2ATP 1, MgCl_2 5,和HEPES 3 (用KOH調(diào)pH至7.2)。電極內(nèi)液中加入兩性霉素B (240μg/ml)。將竇房結(jié)細(xì)胞鉗制在-40 mV,從-50 mV開始以階躍電壓-10 mV的方式逐步超極化至-110 mV,持續(xù)3s,然后復(fù)極至- 40 mV,記錄到I_f電流。該電流可以被2 mM CsCl完全阻斷。 記錄I_(ks)的細(xì)胞外液(in mM) :NaCl, 132; KCl, 4; CaCl_2, 1.8; MgCl_2, 1.2; glucose, 5和HEPES 10 (用NaOH調(diào)pH至7.4);加Nimodipine (1μM)加到外液中用于阻斷I_(CaL)、加入2μM E-4031阻斷I_(kr)。。電極內(nèi)液(in mM) :potassium asparate 70, KCl 50, KH_2PO_4 10, Na_2ATP 3, LiGTP 0.1, EGTA, 5和HEPES 5 (用KOH調(diào)pH至7.2)。將細(xì)胞鉗制在-50 mV,從-40 mV以階躍電壓10 mV的方式去極化至+50 mV,維持2s,然后復(fù)極至-40 mV,誘發(fā)I_(ks)外向尾電流。 記錄I_(CaL)的細(xì)胞外液(in mM):NaCl 135, CsCl 10, MgCl_2 1, CaCl_2 1.8, glucose, 10, HEPES 5和tetrodotoxin 0.003 (用NaOH調(diào)pH至7.4).;電極內(nèi)液(in mM):aspartic acid 90, NaCl 10, CsOH 100, CsCl 30, MgCl_2 2, EGTA 5, CaCl_2 2, HEPES 10, ATPNa_2 2和GTPNa_2 0.1 (用KOH調(diào)pH至7.2)。將細(xì)胞鉗制在-50 mV,從-40 mV以階躍電壓10 mV的方式去極化至+50 mV,維持300 ms,然后復(fù)極至-40 mV,誘發(fā)內(nèi)向I_(CaL)電流。 以上實(shí)驗(yàn)均在36±1℃條件下進(jìn)行。 結(jié)果:灌流外液中加入AngⅡ后可明顯降低竇房結(jié)細(xì)胞的自動起搏頻率,抑制作用在第3 min出現(xiàn),10 min左右達(dá)到穩(wěn)態(tài),沖洗后抑制作用不能完全恢復(fù),AngⅡ(100 nM)使自發(fā)起搏頻率和舒張期去極化頻率分別從171±5 beats /min和150±5 mV/s降至113±8 beat/min(P0.05)和70±6 mV/s (P0.01)。以自發(fā)起搏頻率抑制率為縱座標(biāo)做出AngⅡ作用的量效曲線,經(jīng)Hill方程擬合后得到IC_(50)為8.34 nM。AT_1受體阻斷劑valsartan(1μM)拮抗AngⅡ?qū)ψ园l(fā)起搏頻率的抑制作用,而AT_2受體阻斷劑PD123319 (1μM )并不影響AngⅡ的作用。AngⅡ并不明顯影響I_f電流幅值,但可顯著增大I_(ks)去極化外向電流及復(fù)極時的尾電流,當(dāng)去極電壓為+50 mV時,尾電流由給藥前的7.0±0.5 pA/pF增大到9.0±0.5 pA/pF(n=6, P 0.01),分析通道動力學(xué)發(fā)現(xiàn),AngⅡ可顯著增大去活時間常數(shù)。此外,AngⅡ可顯著抑制I_(CaL)電流,當(dāng)去極電壓為+10 mV時,AngⅡ(100 nM)使I_(CaL)電流密度峰值由給藥前的11.3±1.6 pA/pF降低到7.5±1.0 pA/pF (n=6, P0.05)。 小結(jié):AngⅡ通過增大I_(ks)、抑制I_(CaL)降低豚鼠竇房結(jié)起搏頻率,這種抑制作用由AT_1受體介導(dǎo)。 第二部分鈣鐘機(jī)制在AngⅡ減慢竇房結(jié)自律性中的作用 目的:觀察AngⅡ是否通過影響竇房結(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)調(diào)控自發(fā)起搏頻率。 方法:(1)在急性分離的豚鼠竇房結(jié)細(xì)胞上,利用共聚焦顯微鏡觀察AngⅡ(100 nM)對細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)的影響。分離竇房結(jié)細(xì)胞后,4℃靜置1小時后,用鈣熒光探針flu-3AM (1μM)孵育細(xì)胞20分鐘后,將細(xì)胞置于36±1℃恒溫灌流槽中,記錄給藥前后鈣熒光強(qiáng)度的變化。(2)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄竇房結(jié)自發(fā)動作電位,觀察細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)被BAPTA螯合或Ryanodine抑制Ca~(2+)釋放對AngⅡ抑制自發(fā)起搏頻率作用的影響。 結(jié)果:(1)首先用激光共聚焦顯微鏡觀察陽性對照藥異丙腎上腺素(ISO)對細(xì)胞內(nèi)鈣的影響。與給藥前(Control)比較, 1μM ISO可顯著性增大細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)51%(熒光強(qiáng)度102.2±4.71 vs. 154.5±4.13, P0.01, n=5 );與Control比較,100 nM AngⅡ可顯著性增大細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)37% (熒光強(qiáng)度111±2.53 vs. 152.4±4.22, P0.01, n=5 )。(2)利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄竇房結(jié)細(xì)胞自發(fā)動作電位,通過吸破細(xì)胞膜,使電極內(nèi)液中20 mM BAPTA進(jìn)入細(xì)胞胞漿。隨著BAPTA在胞漿中透析,自發(fā)動作電位頻率逐漸減慢,在吸破細(xì)胞膜第60s,自發(fā)動作電位完全消失。電極內(nèi)液中加入1 mM BAPTA,破膜后自發(fā)動作電位頻率減慢,4分鐘后趨向穩(wěn)定,由176±10次/分鐘下降至86.2±5次/分鐘(減少51%)(P0.01, n=6),在此基礎(chǔ)加入100 nM AngⅡ,細(xì)胞自發(fā)起搏頻率進(jìn)一步下降至38.72±4次/分鐘(與給藥前比較減少78%),與不加BAPTA情況相比,100 nM AngⅡ抑制作用顯著性增強(qiáng)。電極內(nèi)液應(yīng)用2μM Ryanodine,竇房結(jié)起搏頻率顯著性降低(P0.01, n=6),從182±12次/分鐘減少至91±6次/分鐘,約減慢50%,10 min后,再應(yīng)用100 nM AngⅡ,AngⅡ?qū)ζ鸩l率不再進(jìn)一步抑制。改用低濃度Ryanodine(100 nM),自發(fā)起搏頻率由180±5次/分鐘降低至122.4±7次/分鐘,下降32%(P0.01, n=6),10min后,作用穩(wěn)定,再應(yīng)用100 nM AngⅡ,自發(fā)起搏頻率由122.4±7次/分鐘降低至100.8±6次/分鐘,與不存在Ryanodine情況相比,100 nM AngⅡ抑制作用顯著性增強(qiáng)。(3)電極外液應(yīng)用非特異性PLC抑制劑U-73122 (100 nM) 10分鐘可完全取消AngⅡ?qū)ψ园l(fā)起搏頻率的抑制作用。 小結(jié):AngⅡ可增加細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度,螯合細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)或抑制Ca~(2+)釋放可增強(qiáng)AngⅡ的作用,提示膜鐘和鈣鐘機(jī)制共同影響了AngⅡ?qū)Ω]房結(jié)細(xì)胞起搏頻率的抑制作用,對膜鐘的調(diào)控降低細(xì)胞自律性,而對鈣鐘的調(diào)控可增加細(xì)胞自律性,其中以對膜鐘的調(diào)控作用占主導(dǎo)地位。AngⅡ?qū)δょ姾外}鐘的調(diào)控均通過激活PLC實(shí)現(xiàn)。 第三部分AngⅡ?qū)Ρ磉_(dá)Kv1.5通道的影響 目的:分析AngⅡ?qū)Ξ愒幢磉_(dá)的Kv1.5通道電流影響及其分子機(jī)制 方法:采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染方法,HEK_293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染人Kv1.5 cDNA及人AT1受體基因,觀察AngⅡ?qū)νǖ离娏鞯挠绊憽?記錄hKv1.5的細(xì)胞外液包括(in mM) NaCl 140, KCl 5.4, MgCl_2 1, CaCl_2 2, glucose 10,HEPES 10 (用NaOH調(diào)pH至7.4).電極內(nèi)液包括(in mM) KCl 140, Mg-ATP 4, MgCl_2 1, EGTA 5,HEPES 10(用KOH調(diào)pH至7.2).將細(xì)胞鉗制在-70 mV,從-60 mV以階躍電壓10 mV的方式去極化至+80 mV,維持100 ms,然后電壓復(fù)極至+40 mV,誘發(fā)外向尾電流。細(xì)胞鉗制在-100 mV,短暫去極至40 mV,然后超極化至-100 mV,持續(xù)2 s,然后從-70 mV開始以階躍電壓10 mV的方式逐步去極化至30 mV,維持5 s,然后細(xì)胞最終去極至40 mV并持續(xù)1s。以在40 mV的最大電流進(jìn)行標(biāo)化,用Boltzmann方程擬合得到失活曲線, 結(jié)果:AngⅡ(100 nM)可著性抑制hKv 1.5電流,應(yīng)用AngⅡ后,第3分鐘左右尾電流幅值減小,20分鐘左右抑制作用達(dá)到穩(wěn)態(tài),沖洗后不能恢復(fù)。在去極電壓為80 mV下,AngⅡ使尾電流由18.22±0.4pA/pF減小3.06±0.5pA/pF(P0.01,n=6)。以最大尾電流電流密度標(biāo)準(zhǔn)化后用Boltzmann方程擬合得到激活曲線, AngⅡ?qū)v1.5通道的半數(shù)激活電壓沒有影響。AngⅡ顯著性減小hKv1.5通道的激活、去激活時間常數(shù)(P0.01,n=6)。應(yīng)用hKv1.5特異性阻斷劑E-4031(2μM)可完全阻斷復(fù)極時的外向尾電流。細(xì)胞鉗制在-100 mV,短暫去極至40 mV,隨后超極化至-100 mV,持續(xù)2s,然后從-70 mV開始以階躍電壓10 mV的方式逐步去極化至30 mV,維持5 s,然后細(xì)胞最終去極至40 mV并持續(xù)1 s。以40 mV的最大電流進(jìn)行標(biāo)化,用Boltzmann方程擬合得到失活曲線,V_(1/2)由-20±1.94 mV變?yōu)?19.4±4.33 mV,無顯著性差異。表明AngⅡ?qū)v1.5通道的穩(wěn)態(tài)失活無明顯影響。PKC抑制劑staurosporin (Stau) (100 nM)存在下,AngⅡ(100 nM)對hKv1.5的抑制由對照的85.0%減少到11.8% ,提示PKC通路介導(dǎo)AngⅡ?qū)Kv1.5的抑制作用。 小結(jié):AngⅡ激動AT_1受體對Kv1.5電流產(chǎn)生抑制作用,這種抑制作用主要由PKC通路介導(dǎo)。 結(jié)論: 1 AngⅡ通過增大I_(ks)抑制I_(CaL)降低豚鼠竇房結(jié)起搏頻率,這種抑制作用由AT_1受體介導(dǎo)。 2膜鐘和鈣鐘機(jī)制共同影響了AngⅡ?qū)Ω]房結(jié)細(xì)胞起搏頻率的抑制作用,其中以膜鐘的調(diào)控作用占主導(dǎo)地位。 3 AngⅡ激動AT_1受體對Kv1.5電流產(chǎn)生抑制作用,這種抑制作用主要由PKC通路介導(dǎo)。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,AngⅡ通過激動AT_1受體對竇房結(jié)細(xì)胞及心房hKv1.5通道具有直接的電生理調(diào)控作用,為病理狀態(tài)下心臟AngⅡ水平升高引發(fā)電生理重構(gòu)、從而易發(fā)心律失常提供了一個可能的解釋。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R331

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2072517