本文選題：三聚氰胺 + trolox　； 參考：《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的研究三聚氰胺導(dǎo)致大鼠腎腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52e)氧化損傷的程度和細(xì)胞凋亡情況以及Trolox對NRK-52e細(xì)胞的保護作用和p38MAPK通路在三聚氰胺致NRK-52e細(xì)胞凋亡過程中的作用。 方法將三聚氰胺直接溶解于DMEM培養(yǎng)基中,分別稀釋至40mM,30mM,24mM,16mM,8mM,0mM,通過MTT試驗確定三聚氰胺對該細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。根據(jù)三聚氰胺對該細(xì)胞的IC50選擇三個劑量24mM,16mM,8mM作為實驗組,并每組都設(shè)立向?qū)?yīng)的Trolox保護組,、其中Trolox的終濃度為5mM。用三聚氰胺和Trolox于培養(yǎng)基中混勻作用于細(xì)胞8h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液并將細(xì)胞裂解收集細(xì)胞裂解液。對細(xì)胞裂解液分別采用氮藍(lán)四唑顯色法(NBT法)檢測樣品中總SOD活性、紫外比色法檢測樣品中的GSH-Px的活性、硫代巴比妥酸法(TBA法)檢測樣品中的MDA含量。另外,對于細(xì)胞培養(yǎng)液采用2,4-二硝基苯肼法檢測其中的乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)活性。采用熒光探針DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測p38和磷酸化p38(p-p38)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。另外,用western blot方法對細(xì)胞內(nèi)p38和p-p38兩種蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。最后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測三聚氰胺致NRK-52e細(xì)胞凋亡的水平以及分別添加trolox和SB203580后細(xì)胞凋亡水平的變化。 結(jié)果三聚氰胺對NRK-52e細(xì)胞的IC50為28.22mM。經(jīng)trolox處理后,IC50為33.05mM。在氧化損傷指標(biāo)的檢測中發(fā)現(xiàn),隨著三聚氰胺濃度的升高抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性下降。相對于空白組,低劑量組中SOD、GSH-Px活性下降顯著(P0.05),中、高劑量三聚氰胺可以導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活性下降極顯著(P0.01)。同時,各組MDA的含量有所升高。與對照組相比,低劑量顯著升高(P0.05),中、高劑量組升高極顯著(P0.01)。在Trolox保護組中,中劑量保護組SOD的活性顯著高于中劑量毒素組(P0.05)；高劑量保護組GSH-Px的活性極顯著高于對應(yīng)毒素組,而MDA含量也顯著低于毒素組(P0.05)。另外,培養(yǎng)液中LDH活性也隨著三聚氰胺的濃度增加而不斷升高,其中中劑量毒素組顯著高于對照組(P0.05),高劑量毒素組極顯著高于對照組(P0.01)。在Trolox保護組中,低中劑量保護組的LDH活性顯著低于其毒素組(P0.05)。細(xì)胞中活性氧的水平,中、高劑量組極顯著高于空白組(P0.01),而中劑量保護組活性氧水平顯著低于毒素組(P0.05)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡時發(fā)現(xiàn),NRK-52e細(xì)胞的凋亡率隨著三聚氰胺濃度的升高而不斷增加,差異顯著(P0.05)。經(jīng)trolox處理后,細(xì)胞凋亡率顯著下降(P0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn),p38蛋白在不同處理組均有表達(dá),其中以三聚氰胺組表達(dá)量最多。p-p38蛋白的表達(dá)出現(xiàn)在三聚氰胺處理組,說明只有出現(xiàn)凋亡信號時,p38蛋白才會被磷酸化從而發(fā)生生物學(xué)作用。與三聚氰胺組相比,經(jīng)SB203580處理后細(xì)胞的p-p38蛋白的表達(dá)量顯著下降(P0.05)。同樣,經(jīng)SB203580處理后的細(xì)胞凋亡率也比對應(yīng)的毒素組降低,說明SB203580通過阻斷p38蛋白磷酸化成p-p38,使其不能發(fā)揮生物學(xué)作用而降低細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)論三聚氰胺可以降低抗氧化酶的活性,加速細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度,破壞了細(xì)胞膜的完整性。同時,三聚氰胺還可以促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧,這也可能是引起細(xì)胞損傷的重要因素之一。另外,在加入保護劑Trolox后,三聚氰胺造成的氧化損傷程度有所降低,并且trolox可以通過提高抗氧化酶的活性、清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基來保護細(xì)胞,使細(xì)胞凋亡發(fā)生的幾率降低。另外,三聚氰胺致NRK-52e細(xì)胞凋亡可能與p38MAPK通路有關(guān),阻斷p38MAPK可以阻斷三聚氰胺所致的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
[Abstract]:Objective To study the extent of oxidative damage of renal tubular epithelial cells ( NRK - 52e ) in rats induced by melamine and the protective effects of Trolox on NRK - 52e cells and the role of p38MAPK pathway in the apoptosis of NRK - 52e cells .

Methods The activity of p38 and p38 ( p - p38 ) in the cells was determined by MTT assay . The activity of p38 and p38 ( p - p38 ) in the cells was determined by MTT assay .

Results The IC50 of melamine on NRK - 52e cells was 28.22 mM . After trolox treatment , the IC50 was 33.05 mM . The activity of SOD and GSH - Px decreased significantly ( P0.01 ) .
The activity of GSH - Px was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . In the Trolox protection group , the activity of P - p38 protein was significantly lower than that in control group ( P0.05 ) .

Conclusion melamine can reduce the activity of antioxidant enzymes , accelerate the lipid peroxidation of cells and destroy the integrity of cell membrane .
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 俞建君;吳芳珍;;反相離子對色譜法測定工業(yè)三聚氰胺含量[J];廣東化工;2007年07期

2 邵靜君;溫家琪;徐世文;;三聚氰胺毒理學(xué)研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2007年12期

3 李培峰，方允中;活性氧對蛋白質(zhì)的損傷作用[J];生命的化學(xué)(中國生物化學(xué)會通訊);1994年06期

4 陳茜;袁慧;謝志輝;郭成志;朱麗;鄧思君;魯銀;魏強;易金娥;;三聚氰胺與三聚氰酸對小鼠腎臟損傷及其機理的研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2010年12期

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本文編號：2071964