本文選題：布氏菌 + 多位點序列分型　； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的:在原有的7個管家基因和1個外膜蛋白的基礎(chǔ)上,新增加Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的兩個毒力因子,利用多個管家基因的序列進(jìn)行分型,建立一種適用于布氏菌的分辨率較高的ST分型方法,用于中國布氏菌分離株的分型,了解菌株的遺傳特征及遺傳進(jìn)化關(guān)系,為我國布氏菌分子流行病學(xué)的研究提供依據(jù)。 方法:以PCR技術(shù)為基礎(chǔ),應(yīng)用測序技術(shù)進(jìn)行多位點序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)研究。選取1953年到2010年我國不同地區(qū)分離到的164株布氏菌分離株和3株疫苗株作為研究對象。通過對國際標(biāo)準(zhǔn)株的比較評價實驗的真實性,用血清學(xué)、噬菌體等方法對164株分離株進(jìn)行再次鑒定驗證實驗的可靠性。在此基礎(chǔ)上對164株布氏菌分離株和3株疫苗株的10對目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,對比得到各目的基因的等位基因,從而判定其ST型,利用MLST在線工具(NRDB、LIAN、eBURST、Tree drawing),對序列的等位基因型、序列型分離、連鎖平衡、聚類、進(jìn)化樹等進(jìn)行分析,確定序列型、了解菌株間的進(jìn)化關(guān)系。 結(jié)果: (1)以布氏菌屬的17株國際標(biāo)準(zhǔn)菌株作為參照,結(jié)果顯示:菌株的完全符合率為81.25%,等位基因的符合率為96.88%。有差別的為羊種菌63/9(cobQ)、牛種菌86/8/59(glk)、牛種菌Tulya(aroA)、綿羊附睪種菌5K33(omp25);經(jīng)過血清學(xué)、噬菌體等方法對164株分離株進(jìn)行復(fù)檢,均與原始結(jié)果相一致。 (2)應(yīng)用MLST分型方法將164株布氏菌和3株疫苗株共分為38個ST型,得到了38個ST型的等位基因譜,其中牛種菌分為13個型,羊種菌分為8個型,豬種菌分為11個型,犬種菌分為6個型,ST-37中既有豬種菌又有犬種菌;疫苗株S2被單獨分為一個型。 (3)分析實驗菌株等位基因多態(tài)性結(jié)果顯示:omp25多態(tài)性變異程度最大,10個位點gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ、omp25、VirB5和VirB8的遺傳多態(tài)性分別為0.6612、0.7867、0.7286、0.5663、0.7035、0.4110、0.7114、0.8996、0.6659、0.5780。 (4)將38個ST進(jìn)行分裂分解、N-J計算方法繪制進(jìn)化樹以及eBRUST分析,顯示羊種菌和牛種菌各聚為一簇,犬種和豬種菌聚在一起。表明牛種、羊種的各自生物型在基因水平上是高度保守的,各自的種相對獨立,具有更高的相似性,而豬種與犬種之間的親緣關(guān)系相近。同時也提示,布氏菌的ST型太少,難分析出不同型間的變異關(guān)系,從另一方面表明,布氏菌是一個高度保守的細(xì)菌,ST型變異小。 結(jié)論: (1)選取了10個管家基因,初步建立了一種新的分類學(xué)方法,為建立中國布氏菌分離株的MLST數(shù)據(jù)庫提供了豐富的數(shù)據(jù)資料。 (2)將菌株的生物型別與得到的ST型相比較,發(fā)現(xiàn)布氏菌的生物型與ST型之間無明顯的相關(guān)性。MLST的分型結(jié)果進(jìn)一步證實了犬種布氏菌不只是一個生物型。 (3)通過對等位基因譜的分析,發(fā)現(xiàn)特異性的SNP位點。牛種布氏菌(除Tulya外)為gap-2;羊種布氏菌中包括三個,即glk-3、trpE-5、VirB5-4;大部分豬種和犬種布氏菌共享的(除標(biāo)準(zhǔn)株豬種5型)dnaK-1。 (4)本研究所用的10個基因位點,依據(jù)其DNA序列進(jìn)行分型,對未知分離株種的鑒定是一種有用的工具。
[Abstract]:Objective : On the basis of the original seven housekeeping genes and one outer membrane protein , the two virulence factors in the type 鈪，

本文編號：2071377