本文選題：懸浮芯片 + 呼吸道感染��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：第一部分呼吸道病毒高通量懸浮芯片檢測(cè)方法的建立 目的建立常見(jiàn)呼吸道病毒的懸浮芯片檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)呼吸道病毒的快速、高通量檢測(cè)。 方法 (1)建立兩組懸浮芯片檢測(cè)方法,1組為流感病毒懸浮芯片檢測(cè)方法,用于流感病毒型/亞型檢測(cè),包括季節(jié)性H1、季節(jié)性H3、新現(xiàn)的新甲型H1N1、高致病性禽流感H5及B型流感病毒；2組為常見(jiàn)呼吸道病毒懸浮芯片檢測(cè)方法,檢測(cè)15種常見(jiàn)呼吸道病毒,其中包括A、B型流感病毒(FluA、FluB)及新現(xiàn)的呼吸道病毒人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、WU多瘤病毒(WUPyV)、NL63型冠狀病毒(Cov NL63)和HKU1型冠狀病毒(Cov HKU1)。 (2)引物和探針設(shè)計(jì)：流感病毒懸浮芯片檢測(cè)方法(1組)引物和探針參照WHO推薦序列合成。常見(jiàn)呼吸道病毒懸浮芯片檢測(cè)方法(2組)病毒的引物和探針設(shè)計(jì)如下：從GenBank下載不同呼吸道病毒的基因序列,用ClustalX進(jìn)行序列比對(duì)后,找到每種病毒的基因保守序列,用Primier5.0和Oligo6.0軟件在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針,盡量使不同病毒引物Tm值接近,引物擴(kuò)增的目的片段大小在100bp-300bp之間。同時(shí)采用Oligo6.0軟件對(duì)設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行引物二級(jí)結(jié)構(gòu)及互相之間形成引物二聚體的能力進(jìn)行評(píng)價(jià),根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果將15對(duì)呼吸道病毒引物分為兩個(gè)pool,用于多重PCR擴(kuò)增。對(duì)探針序列進(jìn)行blast比對(duì),評(píng)價(jià)其特異性。 (3)探針與微球耦聯(lián)：按照微球供應(yīng)商提供的方法進(jìn)行探針與微球的耦聯(lián),并用倍比稀釋的與探針互補(bǔ)的validation oligo進(jìn)行耦聯(lián)效果評(píng)價(jià)。1組用與季節(jié)性H1、H3、新甲型H1N1及B型流感病毒探針互補(bǔ)的validation oligo進(jìn)行了耦聯(lián)效果評(píng)價(jià),2組用與OC43型冠狀病毒(Cov OC43)、HMPV、FluA及FluB探針互補(bǔ)的validation oligo進(jìn)行了耦聯(lián)效果評(píng)價(jià) (4)多重PCR擴(kuò)增及雜交條件優(yōu)化：1組為5重PCR擴(kuò)增,2組分為兩個(gè)pool,1個(gè)為7重PCR擴(kuò)增,另1個(gè)為8重PCR擴(kuò)增。通過(guò)不同退火溫度及引物濃度組合,優(yōu)化反應(yīng)條件及引物濃度。優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件后,在不同溫度下將PCR產(chǎn)物與耦聯(lián)有探針的微球進(jìn)行雜交,用Bio-Plex 200檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè),優(yōu)化雜交溫度。標(biāo)本熒光強(qiáng)度值(MFI)=陰性對(duì)照標(biāo)本5倍判斷為陽(yáng)性。 (5)用本實(shí)驗(yàn)室保存的不同型/亞型的流感病毒毒株(H5亞型除外)按TCID50(半數(shù)組織細(xì)胞感染量)倍比稀釋后進(jìn)行1組懸浮芯片檢測(cè),評(píng)價(jià)敏感性和特異性。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的14種常見(jiàn)呼吸道病毒(副流感病毒2型(PIV2)除外)陽(yáng)性標(biāo)本及滅活H5亞型流感病毒培養(yǎng)液進(jìn)行RT-PCR/PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物純化、定量后,10倍系列稀釋核酸進(jìn)行2組懸浮芯片檢測(cè)(H5亞型純化產(chǎn)物稀釋液進(jìn)行1組懸浮芯片檢測(cè)),評(píng)價(jià)所建立方法的敏感性和特異性。 (6)臨床標(biāo)本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：按照以上建立的方法,對(duì)2009年1月采集的8份及2010年2月采集的100份流感樣病例(ILI)的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行1組懸浮芯片檢測(cè),并與WHO推薦的Real-time PCR方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。對(duì)2008年9月-2009年12月采集的88份下呼吸道感染患者的鼻咽吸取物(NPA)標(biāo)本進(jìn)行2組懸浮芯片檢測(cè),并與單引物PCR(檢測(cè)HBoV及WUPyV)和多重PCR試劑盒(Seegeen,韓國(guó))檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)果 (1)單引物PCR驗(yàn)證引物：用設(shè)計(jì)的不同呼吸道病毒特異的引物對(duì)已知呼吸道病毒陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增,均擴(kuò)增出目的條帶,說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物可用于后續(xù)多重PCR方法建立。 (2)探針與微球耦聯(lián)：不同稀釋度vallidation olligo與微球雜交后MFI值均與vallidation olligo的稀釋倍數(shù)成正比,最高稀釋度的vallidation olligo與微球雜交后MFI值也在700以上,說(shuō)明探針與微球耦聯(lián)成功。 (3)多重PCR擴(kuò)增條件及雜交溫度優(yōu)化：用不同型/亞型流感病毒和已知病毒陽(yáng)性的標(biāo)本核酸進(jìn)行梯度多重PCR擴(kuò)增,1組和2組多重PCR的最佳退火溫度分別為60℃和62℃。通過(guò)不同引物濃度組合比較,確定了多重PCR的最佳引物濃度。1組和2組懸浮芯片檢測(cè)方法的最佳雜交溫度分別為54℃和50℃。 (4)敏感性：1組懸浮芯片檢測(cè)方法的敏感性為季節(jié)性H1N1亞型5TCID50/mL、季節(jié)性H3N2亞型0.05 TCID50/mL、新甲型H1N1 0.05 TCID50/mL、B型5TCID50/mL及H5亞型10-8ng/μL; 2組懸浮芯片檢測(cè)方法的敏感性為HMPV 10-8ng/μL、HBoV 10-9ng/μL、WUPyV 10-8ng/μL、Adv(腺病毒)10-8ng/μL、Cov OC43 10-8ng/μL、Cov 229E (229E型冠狀病毒)10-7ng/μL、Cov NL63 10-8ng/μL、Cov HKU1 10-8ng/μL、PIV1 (副流感病毒1型)10-9ng/μL、PIV3(副流感病毒3型)10-9ng/μL、HRV(鼻病毒)10-7ng/μL、RSV(呼吸道合胞病毒)10-8ng/μL、FluA 10-9ng/μL、FluB 10-8ng/μL。 (5)特異性：用1組和2組懸浮芯片方法檢測(cè)不同型/亞型流感病毒或不同種類(lèi)呼吸道病毒,病毒之間均無(wú)交叉反應(yīng)。 (6)108份咽拭子標(biāo)本進(jìn)行1組懸浮芯片檢測(cè),結(jié)果與Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致,符合率100%。88份NPA標(biāo)本進(jìn)行2組懸浮芯片檢測(cè),與多重PCR試劑盒(Seegeen)及單引物PCR結(jié)果進(jìn)行比較,2組懸浮芯片方法檢測(cè)不同呼吸道病毒的靈敏度為50.0%M00.0%,特異度為96.4%-100.0%,陽(yáng)性預(yù)期值為33.3%-100.0%,陰性預(yù)期值為94.8%-100.0%,符合率為93.2%-100%。 結(jié)論本文成功建立了包括新現(xiàn)呼吸道病毒(新甲型H1N1流感病毒、HMPV、HBoV、WUPyV、Cov NL63及Cov HKU1)在內(nèi)的流感病毒和常見(jiàn)呼吸道病毒懸浮芯片檢測(cè)方法,并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定了最佳實(shí)驗(yàn)方案。該方法的敏感性、特異性均較好,檢測(cè)時(shí)限為6h,同時(shí)可檢測(cè)15種常見(jiàn)呼吸道病毒及5種型/亞型流感病毒。 第二部分新現(xiàn)呼吸道病毒的分子特征分析 目的研究新現(xiàn)呼吸道病毒新甲型H1N1流感病毒、HMPV、HBoV及WUPyV的感染狀況及病毒相關(guān)基因特性。 方法 (1)用病毒分離或Real——time PCR法,對(duì)2009年4月-2011年3月采集的IL1咽拭子標(biāo)本和重癥呼吸道感染患者的NPA、鼻咽拭子及氣管盥洗液等呼吸道標(biāo)本進(jìn)行包括新現(xiàn)甲型H1N1在內(nèi)的流感病毒檢測(cè)。并對(duì)分離自上述病例中重癥/死亡病例的14株新甲型H1N1流感病毒毒株進(jìn)行HA基因序列測(cè)定,其中6株進(jìn)行NA基因序列測(cè)定,3株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定,分析序列特征,繪制種系發(fā)生樹(shù)。 (2)采集2006年和2008年春季、2008年和2009年秋冬季的急性呼吸道感染住院兒童的310份NPA標(biāo)本,進(jìn)行巢式RT-PCR擴(kuò)增HMPVN和F基因片段,RT-PCR擴(kuò)增G基因,并對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列分析,繪制種系發(fā)生樹(shù)。同時(shí)收集所有陽(yáng)性患者的臨床資料。并采用PCR和多重PCR對(duì)HMPVN基因陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行其他呼吸道病毒檢測(cè)。HMPV檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本同時(shí)用Vero-E6和LLC-MK2細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。 (3)采集2008年春季、2008年秋冬季和2009年冬春季的急性下呼吸道感染住院兒童的238份NPA標(biāo)本,采用PCR檢測(cè)HBoV NP-1基因片段,并對(duì)VP1/VP2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析,繪制種系發(fā)生樹(shù)。同時(shí)采用PCR和多重PCR檢測(cè)其它呼吸道病毒。 (4)采集2008年春季、2008年秋冬季和2009年冬春季的急性下呼吸道感染住院兒童的NPA標(biāo)本238份,2009年冬季的急性上呼吸道感染的咽拭子標(biāo)本68份以及2009年2月-11月對(duì)照組咽拭子標(biāo)本43份,進(jìn)行WUPyV VP2基因片段PCR擴(kuò)增,同時(shí)對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性標(biāo)本采用PCR和多重PCR檢測(cè)其他呼吸道病毒。 結(jié)果 (1)流感病毒 2009年4月-2011年3月共檢測(cè)呼吸道標(biāo)本7931份(其中ILI咽拭子標(biāo)本6177份,重癥呼吸道感染病例呼吸道標(biāo)本754份),1567份(19.8%)檢出流感病毒。2009年4月-2009年9月、2009年10月-2010年3月、2010年4月-2010年9月和2010年10月-2011年3月四個(gè)監(jiān)測(cè)季流感病毒優(yōu)勢(shì)流行亞型分別為季節(jié)性H3(60.8%,185/304)、新甲型H1N1(76.8%,630/820)、季節(jié)性H3(77.6%,118/152)和新甲型H1N1(51.5%,150/291)。四個(gè)監(jiān)測(cè)季中季節(jié)性H3亞型流感病毒HA基因變異較小,屬抗原漂移。 (2)新甲型H1N1流感病毒： 1567份流感病毒陽(yáng)性標(biāo)本中,56.3%(882/1567)為新甲型H1N1流感病毒。25.5%(192/754)的重癥呼吸道感染病例為新甲型H1N1流感病毒陽(yáng)性。不同監(jiān)測(cè)季新甲型H1N1流感病毒在所有流感病毒中的構(gòu)成比如下：2009年4月-2009年9月為33.6%(102/304),2009年10月-2010年3月為76.8%(630/820),2010年4月-2010年9月為0.6%(1/152),2010年10月-2011年3月為51.5%(150/291)。新甲型H1N1流感病毒為2009年10月-2010年3月和2010年10月-2011年3月兩個(gè)監(jiān)測(cè)季的優(yōu)勢(shì)流行亞型。種系發(fā)生分析顯示,新甲型HIN1流感病毒的HA、NA、M、NP和NS基因來(lái)源于豬流感病毒,PB2和PA基因來(lái)源于禽流感病毒,PB1基因來(lái)源于人流感病毒。天津地區(qū)新甲型H1N1流感病毒8個(gè)片段與WHO推薦的疫苗株A/California/07/2009(H 1N1)及中國(guó)的代表株A/Sichuan/1/2OO9(H1N1)相比,同源性很高,為98.2%-99.5%。HA基因氨基酸序列與疫苗株比較,未發(fā)現(xiàn)受體結(jié)合位點(diǎn)變異。NA基因氨基酸序列分析顯示,天津地區(qū)新甲型H1N1流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑(如達(dá)菲)敏感。 (3) HMPV 310份NPA標(biāo)本中共檢出20份(6.5%)HMPV。HMPV陽(yáng)性患兒的臨床診斷均為支氣管肺炎,其臨床癥狀以咳嗽、喘息、呼吸急促、發(fā)燒等常見(jiàn)。HMPV陽(yáng)性患兒的年齡中位數(shù)為15.0個(gè)月(16d-9歲),其中=2歲患兒占90.0%(18/20)。男性占60.0%(12/20)。17株HMPVN基因和18株HMPVF基因種系發(fā)生樹(shù)分析顯示,14株為A型(其中13株為A2b亞型),6株為B型。A、B型間臨床特征未見(jiàn)明顯差別。G基因變異最大,N和F基因片段相對(duì)保守。2例HMPV陽(yáng)性患兒分別與腺病毒和鼻病毒混合感染。HMPV的細(xì)胞分離較困難,用Vero-6細(xì)胞從PCR陽(yáng)性標(biāo)本中成功分離到HMPV, Vero-E6分離HMPV優(yōu)于LLC-MK2。 (4) HBoV 238份NPA標(biāo)本中,17份(7.1%)為HBoV陽(yáng)性。所有陽(yáng)性患兒的年齡均=6y,男14例,女3例。6月-1y患兒感染率最高,為16.0%(8/50)。17例HBoV陽(yáng)性患兒均為肺炎和喘息性支氣管炎患者。14份(82.4%)合并其它呼吸道病毒感染。13株HBoVVP1/VP2基因擴(kuò)增成功,VPl/VP2基因序列種系發(fā)生分析表明,13株HBoV均與瑞典分離的代表株ST2株(1b簇)聚在一個(gè)分支上,均屬于1b簇。 (5) WUPyV 238份下呼吸道感染的NPA標(biāo)本中,45份(18.9%)WUPyV VP2基因陽(yáng)性。陽(yáng)性患兒年齡中位數(shù)為9.0個(gè)月(6d-6y),=6個(gè)月檢出率最高(37.8%,17/45),男28例,女17例。WUPyV陽(yáng)性標(biāo)本中,80%(36/45)與其他呼吸道病毒混合感染,其中RSV B占35.6%(16/45)。68份門(mén)診上呼吸道感染兒童的咽拭子標(biāo)本中,僅4.4%(3/68)為WUPyV VP2基因片段PCR擴(kuò)增陽(yáng)性,與上述下呼吸道感染的陽(yáng)性率18.9%相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=8.4,P=0.0037)。43例對(duì)照組兒童的咽拭子標(biāo)本經(jīng)WUPyV VP2基因檢測(cè)均為陰性。 結(jié)論 (1)流感病毒是冬春季重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的呼吸道病毒,2009年4月-2011年3月4個(gè)監(jiān)測(cè)季的優(yōu)勢(shì)流行亞型分別為季節(jié)性H3、新甲型H1N1、季節(jié)性H3和新甲型H1N1。季節(jié)性H3亞型流感病毒HA基因變異屬抗原漂移。 (2)天津地區(qū)2009年6月出現(xiàn)新甲型H1N1流感病毒,2009年10月-2010年3月達(dá)流行高峰(76.8%),2010年4月-2010年9月急劇下降(0.6%),2010年10月-2011年3月又成為優(yōu)勢(shì)流行亞型(51.5%)。新甲型H1N1流感病毒可引起肺炎等重癥呼吸道感染。新甲型H1N1流感病毒的HA、NA、M、NP和NS基因來(lái)源于豬流感病毒,PB2和PA基因來(lái)源于禽流感病毒,PB1基因來(lái)源于人流感病毒,其為三重重排病毒,與國(guó)外報(bào)道一致。目前的新甲型H1N1流感病毒基因與國(guó)外毒株相比,無(wú)顯著變異。NA氨基酸序列分析表明,天津地區(qū)無(wú)達(dá)菲耐藥株出現(xiàn)。 (3) HMPV、HBoV及WUPyV均在下呼吸道感染患者中檢出率高,且都有混合感染。天津地區(qū)流行的HMPV以A2b為優(yōu)勢(shì)流行型,HBoV均屬于1b簇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R373

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張曉娜;AIV，NDV，，IBV和ILTV液相檢測(cè)芯片方法的建立[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2061902