本文選題：長雙歧桿菌NCC2705(B. + longum　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年博士論文

【摘要】：雙歧桿菌(Bifidobacterium,B. longum)是人體腸道內(nèi)最重要的益生菌,具有改善營養(yǎng)、增強(qiáng)免疫、抗過敏、抗腫瘤、抗感染、抗衰老、調(diào)整腸道菌群平衡等諸多重要的生理功能。隨著雙歧桿菌制品在世界范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用及微生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,雙歧桿菌受到了越來越多的重視,并已成為腫瘤靶向治療和基因疫苗載體的理想研究對(duì)象。雙歧桿菌具有廣泛的代謝途徑,以便在腸道逆境中迅速利用稀少的宿主不能降解的碳水化合物并形成生長優(yōu)勢,進(jìn)而定植和生存。幾種非消化性的碳水化合物如寡聚果糖、菊粉和棉子糖已經(jīng)被證明為益生因子并作為食品添加劑選擇性促進(jìn)雙歧桿菌在腸道中的生長。人的腸道中存在很多種類的單糖、雙糖和低聚糖,盡管雙歧桿菌能利用這些單糖作為唯一的碳源,但目前對(duì)將這些糖吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)的特異性和代謝途徑的分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過對(duì)長雙歧桿菌NCC2705糖發(fā)酵的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,闡述了長雙歧桿菌NCC2705中一個(gè)新型糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組成成分、蛋白功能、相互作用,并對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行了分子機(jī)制的相關(guān)研究。 首先,我們明確了B. longum NCC2705能夠利用六種單糖作為唯一碳源生長,包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖和甘露糖。生長曲線表明,B. longum NCC2705在果糖、核糖、木糖和半乳糖中比在葡萄糖和甘露糖中有更高的生長率。在B. longum NCC2705的生長過程中,其發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸和乳酸的摩爾比從1.27到2.61,乳酸產(chǎn)生量由低到高依次為甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、核糖、果糖。這表明雙歧桿菌可以偏好性優(yōu)先利用果糖、核糖、木糖作為碳源。 為了確定B. longum NCC2705單糖的代謝通路,我們對(duì)以果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、核糖和葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長的B. longum NCC2705進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。與在葡糖糖培養(yǎng)基中生長的NCC2705相比,在果糖、半乳糖、木糖、核糖和甘露糖中生長的NCC2705總共鑒定到136個(gè)差異蛋白點(diǎn),通過MALDI-TOF/TOF MS/MS和ESI-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定共68個(gè)蛋白表現(xiàn)出了3倍以上的差異表達(dá)。同時(shí),提取了B. longum NCC2705的總RNA分析這些基因在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行半定量RT-PCR分析,半定量RT-PCR的結(jié)果同蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果一致。這些差異蛋白主要包括:(1)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)成分;(2)代謝酶類;(3)關(guān)鍵的應(yīng)激酶;(4)翻譯相關(guān)蛋白;(5)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白;(6)假想蛋白。這些差異蛋白大多為胞質(zhì)蛋白,其中4個(gè)蛋白序列預(yù)測含有信號(hào)肽。這些結(jié)果表明,碳源的改變可以對(duì)B. longum NCC2705產(chǎn)生廣泛的影響。 此外,有多個(gè)蛋白在2-D凝膠上出現(xiàn)了位移的現(xiàn)象,我們推測可能是這些蛋白發(fā)生了斷裂或翻譯后修飾。因此對(duì)這些蛋白進(jìn)行Pro-Q磷酸化染色并結(jié)合一抗分別是抗磷酸基-絲氨酸(Anti-phosphor-serine,Anti-P-Ser)、抗磷酸基-蘇氨酸(Anti-phosphor-threonine,Anti-P-Thr)、抗磷酸基-酪氨酸(Anti-phosphor- tyrosine ,Anti-P-Tyr)的Western Blot技術(shù),結(jié)果顯示包括伴侶蛋白(GroEL, BL0002)、烯醇酶(Eno, BL1022)、轉(zhuǎn)醛醇酶(Tal, BL0715)和葡萄糖磷酸變位酶(Pgm, BL1630)存在著不同的磷酸化。這四個(gè)蛋白均含有磷酸化的絲氨酸殘基,并且伴侶蛋白(GroEL, BL0002)和烯醇酶(Eno, BL1022)都是在酪氨酸殘基位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。 本研究中值得關(guān)注的是,BL0033(可能的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的糖結(jié)合蛋白),在果糖、核糖和木糖培養(yǎng)基中出現(xiàn)了高豐度的表達(dá)。相對(duì)于在葡萄糖培養(yǎng)基中的表達(dá),BL0033的表達(dá)豐度在上述三個(gè)培養(yǎng)基中出現(xiàn)了高達(dá)50倍的上調(diào)。通過MALDI-TOF/TOF MS/MS和ESI-MS/MS質(zhì)譜結(jié)果,我們鑒定出BL0033在果糖培養(yǎng)基中生長時(shí)有5個(gè)同分異構(gòu)體,Pro-Q染色及Western Blot結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)BL0033的磷酸化反應(yīng),并且確定了其磷酸化發(fā)生于絲氨酸和酪氨酸殘基,其中一個(gè)主要磷酸化位點(diǎn)位于絲氨酸殘基,其余四個(gè)磷酸化位點(diǎn)位于酪氨酸殘基。 生物信息學(xué)分析表明,BL0033屬于一個(gè)糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),該系統(tǒng)共有四個(gè)組成蛋白:BL0033、BL0034、BL0035、BL0036。其中BL0033被注釋為可能的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的糖結(jié)合蛋白,BL0034被注釋為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的ATP結(jié)合蛋白,BL0035和BL0036被注釋為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的透性酶。果糖、木糖、核糖、葡萄糖濃度梯度和時(shí)間梯度的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,顯示BL0033能夠被果糖、木糖和核糖誘導(dǎo)表達(dá),并且果糖對(duì)其誘導(dǎo)具有明顯的特異性和可逆性。同時(shí),半定量RT-PCR結(jié)果顯示BL0034、BL0035和BL0036在轉(zhuǎn)錄水平也具有較顯著的提高,暗示BL0033-BL0036可能是一個(gè)果糖、木糖、核糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。 為了驗(yàn)證BL0033、BL0034、BL0035和BL0036的生物學(xué)功能,先后用毛細(xì)管電泳、ATP結(jié)合實(shí)驗(yàn)、超濾純化等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了這些蛋白的表達(dá)純化及功能驗(yàn)證。通過毛細(xì)管電泳技術(shù),發(fā)現(xiàn)BL0033能夠結(jié)合果糖、木糖和核糖,并且表現(xiàn)出對(duì)果糖的高結(jié)合特性,BL0035和BL0036均能結(jié)合果糖、木糖、核糖;通過ATP結(jié)合實(shí)驗(yàn),證實(shí)BL0034有ATP結(jié)合特性。 BL0033、BL0034、BL0035、BL0036作為一個(gè)可能的糖轉(zhuǎn)運(yùn)ABC系統(tǒng),在發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)底物的生理功能時(shí),必然存在著相互作用。進(jìn)一步表達(dá)和純化分別含有GST標(biāo)簽和His標(biāo)簽的這個(gè)系統(tǒng)的所有蛋白,應(yīng)用GST pull-down和Western Blot,分別驗(yàn)證了四種蛋白之間存在著兩兩相互作用。為了進(jìn)一步研究BL0033和BL0034相互作用時(shí)的作用位點(diǎn),構(gòu)建了帶有His標(biāo)簽的BL0033和BL0034的截短突變體:BL0033/1-23、BL0033/36-314、BL0034/8-244、BL0034/33-220和BL0034/289-481,分別代表了兩個(gè)蛋白的不同的基序。從GST pull-down和Western Blot的結(jié)果分析來看,BL0033的1-23aa基序是BL0033與BL0034發(fā)生作用的區(qū)域,而BL0034的33-220aa基序則是BL0034與BL0033發(fā)生作用的氨基酸區(qū)域。BL0033的1-23aa結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)DNA重組介質(zhì)氨基酸序列,可以與BL0034的包含有ATP結(jié)合序列的33-220aa氨基酸區(qū)域相結(jié)合。而且進(jìn)一步的Pro-Q染色結(jié)果表明,BL0033的36-314aa氨基酸序列,在翻譯后修飾的過程中被磷酸化,這個(gè)結(jié)構(gòu)域部分應(yīng)該包含有果糖、木糖、核糖的結(jié)合蛋白,表明該3種糖底物可以引起B(yǎng)L0033在底物結(jié)合時(shí)的磷酸化反應(yīng),從而激活轉(zhuǎn)運(yùn)過程,將底物從胞外轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)。 通過上述實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果,BL0033作為底物結(jié)合蛋白,BL0034作為ATP結(jié)合蛋白,BL0035、BL0036作為底物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,符合一個(gè)典型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的所有構(gòu)件組成,并且存在整個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)的相互作用,結(jié)合基因?qū)W上的相關(guān)性,因此我們提出了一個(gè)新的糖結(jié)合蛋白ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),命名為B. longum NCC2705中的果糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
[Abstract]:Bifidobacterium longum is the most important probiotics in human intestinal tract , and has many important physiological functions such as improving nutrition , enhancing immunity , resisting allergy , resisting tumor , resisting infection , resisting aging and regulating intestinal flora balance .

The growth curve shows that B . longum NCC2705 has higher growth rate than glucose and mannose in fructose , ribose , xylose and galactose . The growth curve shows that B . longum NCC2705 has higher growth rate in fructose , ribose , xylose and galactose than in glucose and mannose .

In order to determine the metabolic pathway of B . longum NCC2705 monosaccharide , we compared the results of protein group with B.longum NCC2705 grown in medium containing fructose , galactose , mannose , xylose , ribose and glucose as the sole carbon source .

In addition , there were a number of proteins on 2 - D gels . We speculate that these proteins may be modified after cleavage or post - translational modification . The results show that these proteins are phosphorylated by Pro - Q phosphorylation and binding to anti - P - Ser , Anti - phosphor - Ser , Anti - P - Thr and Anti - phosphor - tyrosine , Anti - P - Tyr . These four proteins both contain phosphorylated serine residues , and both GroEL , BL0002 and Eno , BL1022 are phosphorylated at the tyrosine residue site .

In this study , BL0033 ( the sugar binding protein of the possible ABC transport system ) was expressed in high abundance in fructose , ribose and xylose medium . The expression abundance of BL0033 was up to 50 times higher than that in the above three media . By MALDI - TOF / TOF MS / MS and ESI - MS / MS mass spectrometry , we identified that BL0033 was phosphorylated in fructosyl medium and its phosphorylation occurred in Ser and tyrosine residues , one of the major phosphorylation sites being located in Ser residue and the remaining four phosphorylation sites at tyrosine residues .

Bioinformatic analysis indicates that BL0033 belongs to a sugar ABC transport system , which has four constituent proteins : BL0033 , BL0034 , BL0035 , and BL0036 . BL0033 is annotated as the sugar binding protein in ABC transport system , BL0034 is annotated as ATP binding protein in ABC transport system , BL0035 and BL0036 are annotated as transglucosidase of ABC transport system . The results show that BL0033 can be induced by fructose , xylose , ribose , glucose concentration gradient and time gradient . The results show that BL0033 - BL0036 can be induced by fructose , xylose and ribose , suggesting that BL0033 - BL0036 may be a fructose , xylose , and ribose ABC transport system .

In order to verify the biological functions of BL0033 , BL0034 , BL0035 and BL0036 , the expression purification and functional verification of these proteins were carried out by capillary electrophoresis , ATP binding experiments , ultrafiltration and purification .

BL0033 / 1 - 23 , BL0033 / 36 - 314 , BL0034 / 8 - 244 , BL0034 / 33 - 220 and BL0034 / 289 - 481 , respectively , show that BL0033 / 1 - 23 , BL0033 / 36 - 314 , BL0034 / 8 - 244 , BL0034 / 33 - 220 and BL0034 / 289 - 481 respectively represent different motifs of BL0033 and BL0034 .

BL0033 , as substrate binding protein , BL0035 and BL0036 as substrate transport protein , is composed of all the components of a typical ABC transport system , and has the function of biological function in the whole system . Therefore , we propose a new carbohydrate binding protein ABC transport system named B.longum NCC2705 .
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 徐杰;布魯氏菌轉(zhuǎn)錄組測序分析及sRNA功能研究[D];吉林大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 尚偉;長雙歧桿菌XY01生理特性和比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];江南大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2061899