本文選題：盆底功能障礙性疾病 + 脂肪源性干細(xì)胞��； 參考：《廣州醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文

【摘要】：【研究背景】 女性盆底功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction,PFD)是指盆底支持結(jié)構(gòu)缺陷、損傷及功能障礙造成的疾患,主要包括壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)、盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)、性功能障礙和糞失禁。據(jù)統(tǒng)計在美國社區(qū)婦女中,約23.7%的婦女存在一種以上的PFD,并且隨著年齡的增長患病率增加。人口老齡化也加重了PFD的疾病負(fù)擔(dān),2005-2006年用于治療PFD的經(jīng)濟(jì)費用較1996-1997年增加約1倍。因此,認(rèn)為PFD是嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量、身心健康以及增加人們負(fù)擔(dān)的慢性疾病之一。 手術(shù)治療是PFD治療的常用方法,女性在80歲前因POP或SUI而需行吊帶手術(shù)治療的幾率為11.1%�，F(xiàn)代的手術(shù)理念是利用補片使盆腔臟器達(dá)到解剖和功能的恢復(fù),補片包括人工合成補片,生物補片。單股、大網(wǎng)孔的聚丙烯補片被認(rèn)為是治療PFD的最好的合成材料,但是其仍然存在一定的手術(shù)并發(fā)癥,包括補片外露、侵蝕、補片皺縮,而因補片引起的疼痛和性交困難的發(fā)生率更高,高達(dá)17%。生物補片由于具有良好的生物相容性,與合成補片相比,與補片相關(guān)的并發(fā)癥發(fā)生率明顯降低,但是術(shù)后補片的降解問題一直是生物補片臨床應(yīng)用的難題。 膠原蛋白是韌帶和筋膜等支持結(jié)構(gòu)的主要組成部分,對維持盆底支持組織的彈性和韌性起重要作用。多項研究表明,女性盆底韌帶筋膜成纖維細(xì)胞以及細(xì)胞基質(zhì)中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量降低,提示成纖維細(xì)胞量的減少以及膠原蛋白含量降低是PFD可能的致病機(jī)理。2003年Lee等用肌源性干細(xì)胞治療大鼠壓力性尿失禁,2010年Yamamoto等報道了2例利用自體脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)治療前列腺根治術(shù)后尿失禁患者,均顯示了良好的效果,提示利用干細(xì)胞治療PFD的可能性。Park等發(fā)現(xiàn)ADSCs能有效促進(jìn)膠原的合成,以及促進(jìn)成纖維細(xì)胞向損傷組織遷移。那么如何促使ADSCs向成纖維細(xì)胞方向分化并分泌更多的膠原蛋白呢?有文獻(xiàn)報道,干細(xì)胞通過與特定的組織細(xì)胞共培養(yǎng)可以促使干細(xì)胞向特定的方向分化。因此,本實驗擬通過ADSCs與鼠胚成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),探討ADSCs和成纖維細(xì)胞合成及分泌膠原蛋白的能力,為ADSCs作為PFD生物治療的種子細(xì)胞提供實驗依據(jù)。 【目的】 1探討ADSCs的分離培養(yǎng)的實驗方法,研究其細(xì)胞表面標(biāo)記物的生物學(xué)特性,觀察其向成脂、成軟骨方向多向分化的潛能,為ADSCs實驗方法學(xué)研究提供實驗數(shù)據(jù)。 2采用ADSCs與鼠胚成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)的方法,探討ADSCs和成纖維細(xì)胞在促進(jìn)Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白合成中的相互作用,為ADSCs應(yīng)用于盆底功能障礙性疾病的治療提供組織工程學(xué)的實驗依據(jù)。 【方法】 1從SD大鼠腹股溝脂肪墊中分離、培養(yǎng)ADSCs,采用MTT(四甲基偶氮唑藍(lán))法進(jìn)行細(xì)胞生長測定,并采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 2采用流式細(xì)胞儀檢測ADSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物:CD34、CD44、CD45、CD49d、CD90、CD105以及CD106。 3應(yīng)用成脂肪誘導(dǎo)因子(地塞米松、胰島素、1-甲基-3-異丙基-黃嘌呤和吲哚美辛)和成軟骨誘導(dǎo)因子(TGF-β1、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和維生素C)誘導(dǎo)ADSCs向成脂、成軟骨方向分化。 4取經(jīng)鑒定的ADSCs和鼠胚成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng),實驗組上層為成纖維細(xì)胞,下層為ADSCs;對照組(1):上下層均為ADSCs;對照組(2):上下層均為成纖維細(xì)胞。每組6個重復(fù)孔,以10~5/孔細(xì)胞數(shù)接種6孔板,半定量RT-PCR檢測不同時間點各組的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)。 5采用ELISA檢測不同時間點各組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的含量。 【結(jié)果】 1體外培養(yǎng)的ADSCs增殖迅速,呈成纖維細(xì)胞樣生長,細(xì)胞呈多角形、長梭形,形態(tài)均一;第1、3、5代細(xì)胞生長曲線呈“S”型;細(xì)胞周期結(jié)果顯示G0/G1期細(xì)胞占90.6%。 2體外培養(yǎng)的ADSCs表面抗原陽性表達(dá)率分別為:CD44 99.88%,CD105 95%, CD90 99.74%,CD49d 89.56%,CD34 3.04%,CD106 0.85%,CD45 0.26%; 3體外培養(yǎng)的ADSCs成脂誘導(dǎo)后,誘導(dǎo)3天后細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴,并不斷的增加、變大融合,誘導(dǎo)7天后部分細(xì)胞胞漿被脂滴完全充滿,誘導(dǎo)14天后油紅“O”染色呈橘紅色。 4體外培養(yǎng)的ADSCs成軟骨誘導(dǎo)后,細(xì)胞團(tuán)形成穩(wěn)定,誘導(dǎo)14天后,細(xì)胞團(tuán)直徑增大至2mm,表面光滑,阿利新藍(lán)染色陽性。 5半定量RT-PCR檢測間接共培養(yǎng)細(xì)胞膠原蛋白mRNA表達(dá)結(jié)果:實驗組下層ADSCsⅠ型膠原蛋白表達(dá)在共培養(yǎng)6天時較對照組(1)下層ADSCs明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;而Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)則在共培養(yǎng)6天和9天時較對照組(1)高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組上層成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)在共培養(yǎng)3天、6天和9天均較對照組(2)上層成纖維細(xì)胞高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 6 ELISA檢測共培養(yǎng)細(xì)胞上清液結(jié)果顯示:間接共培養(yǎng)三組間的細(xì)胞培養(yǎng)上清液Ⅰ型膠原蛋白含量在6天和9天時有差異,差異具有顯著性,其中實驗組和對照組(2)的含量要高于對照組(1),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而實驗組與對照組(2)差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而Ⅲ型膠原蛋白含量在培養(yǎng)3天和6天時有差異,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其中實驗組和對照組(2)的含量要高于對照組(1),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而實驗組與對照組(2)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 【結(jié)論】 1本實驗成功分離培養(yǎng)了ADSCs,其細(xì)胞表面標(biāo)記符合ADSCs的特點。ADSCs能向成脂和成軟骨分化,說明它具有多向分化的潛能.,可作為盆底缺陷生物工程學(xué)中的重要種子細(xì)胞。 2 ADSCs與鼠胚成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后,通過細(xì)胞間的分泌相互影響,上調(diào)Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的基因表達(dá),促進(jìn)Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白分泌。
[Abstract]:BACKGROUND OF THE STUDY

Female pelvic floor dysfunction ( PFD ) refers to the disease caused by defect , damage and dysfunction of pelvic floor support structure , mainly including stress urinary incontinence , stress urinary incontinence , pelvic organ prolapse ( POP ) , sexual dysfunction and fecal incontinence . According to the statistics , in the American community women , about 23 . 7 % of women have more than one PFD , and with the increase of age . Population aging also increases the disease burden of PFD . In 2005 - 2006 , the economic cost for the treatment of PFD is increased by about 1 fold from 1996 - 1997 . Therefore , it is considered that PFD is one of the chronic diseases which seriously affect the quality of life , physical and mental health of women and increase people ' s burden .

Surgical treatment is a common method for PFD therapy , and the rate of surgical treatment for women before the age of 80 is 11.1 % . The modern surgical concept is to use the patch to restore the pelvic viscera to anatomy and function . However , it still has some surgical complications , including the exposure to patch , erosion , patch shrinkage , and the complication rate associated with the patch due to patch exposure , erosion and patch shrinkage .

The study shows that the decrease of collagen content and the decrease of collagen content in women pelvic floor ligament fibroblasts as well as the decrease of collagen content are the possible pathogenic mechanism of PFD . In 2003 , it is suggested that stem cells can effectively promote the synthesis of collagen and promote the migration of fibroblasts to injured tissues .

Purpose of the project

Objective To investigate the biological characteristics of ADSCs and to observe the biological characteristics of their cell surface markers , and to observe their potential in the direction of adipogenesis and chondrogenic differentiation , and to provide experimental data for experimental methodological research of ADSCs .

2 The interaction of ADSCs and fibroblasts in promoting the synthesis of type 鈪，

本文編號：2060931