本文選題：剛地弓形蟲 + 棒狀體蛋白　； 參考：《中國人獸共患病學(xué)報(bào)》2016年03期

【摘要】：目的構(gòu)建弓形蟲棒狀體蛋白ROP18重組腺病毒載體,研究其對神經(jīng)干細(xì)胞C17.2凋亡的影響。方法將弓形蟲ROP18從PEGFP-G2-ROP18重組質(zhì)粒上亞克隆至腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP,重組腺病毒載體pHBAd-MCMVGFP-ROP18經(jīng)PCR、測序鑒定正確后,與骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝,收獲、擴(kuò)增重組腺病毒并對其滴度進(jìn)行測定。以MOI=70的重組腺病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞C17.2,轉(zhuǎn)染不同時間熒光顯微鏡觀察基因的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染48h用CCK-8法檢測C17.2的增殖情況;轉(zhuǎn)染24h采用Annexin V-APC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況;Western blot法檢測半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平。結(jié)果重組ROP18過表達(dá)腺病毒在C17.2神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)能有效表達(dá)。轉(zhuǎn)染48h,與空載體對照組相比,C17.2細(xì)胞增殖活性明顯降低(P0.05);轉(zhuǎn)染24h,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,ROP18基因轉(zhuǎn)染組C17.2細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.001);Western blot檢測顯示caspase-3活性片段的表達(dá)明顯增加(P0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了弓形蟲ROP18重組腺病毒并在神經(jīng)干細(xì)胞C17.2中表達(dá),ROP18重組腺病毒能誘導(dǎo)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Aim to construct the recombinant adenovirus vector of Toxoplasma gondii ropiform protein ROP18 and to study the effect of ROP18 on apoptosis of neural stem cells (NSCs). Methods Toxoplasma gondii ROP18 was subcloned from PEGFP-G2-ROP18 recombinant plasmid into adenovirus vector pHBAd-MCMV-GFP.The recombinant adenovirus vector pHBAd-MCMVGFP-ROP18 was confirmed by PCR.The recombinant adenovirus vector pHBAd-MCMVGFP-ROP18 was cotransfected with the skeleton plasmid pHBAd-BHG into HEK293 cells for harvesting. The recombinant adenovirus was amplified and its titer was determined. C17.2 neural stem cells were infected with the recombinant adenovirus of MOIX70, and the expression of the gene was observed by fluorescence microscope at different time. The proliferation of C17.2 was detected by CCK-8 method at 48h, and the cell apoptosis was detected by Annexin V-APC / Pi double staining flow cytometry at 24h. The protein level of cysteine aspartate protease 3 (caspase-3) was detected by Western blot assay. Results Recombinant ROP 18 overexpression adenovirus could be expressed effectively in C 17.2 neural stem cells. After 48 h transfection, the proliferative activity of C17.2 cells was significantly lower than that of empty vector control group (P0.05), and the apoptotic rate of C17.2 cells was significantly increased (P0.001) Western blot assay showed that the expression of caspase-3 activity fragment was significantly increased (P0.05) in 24 h transfection group. Conclusion the recombinant adenovirus of Toxoplasma gondii ROP18 was successfully constructed and expressed in neural stem cell C17.2. The recombinant adenovirus can induce apoptosis of C17.2 neural stem cells.
【作者單位】： 安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室;人獸共患病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(No.81572022)資助 安徽醫(yī)科大學(xué)青年拔尖人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(No.0113014104)資助~~
【分類號】：R382.5

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本文編號：2058622