本文選題：肺炎鏈球菌 + D39Δ1672��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：背景本課題組前期工作從肺炎鏈球菌中篩選到一些體內(nèi)誘導(dǎo)基因,這些體內(nèi)誘導(dǎo)基因可能與細(xì)菌感染致病有關(guān)。spd1672基因是其中的一個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因,經(jīng)過生物信息學(xué)分析,其表達(dá)產(chǎn)物SPD1672蛋白含有脂質(zhì)A核心-O抗原連接酶結(jié)構(gòu)域,提示該基因可能與細(xì)菌細(xì)胞壁多糖形成相關(guān),本課題擬對(duì)spd1672基因功能進(jìn)行鑒定,探尋它影響細(xì)胞壁多糖合成的生物學(xué)證據(jù),并進(jìn)一步研究其在感染致病過程中的毒力機(jī)制。 方法首先通過基因替代失活法構(gòu)建肺炎鏈球菌spd1672基因缺陷菌(D39△1672);通過透射電子顯微鏡對(duì)細(xì)菌莢膜厚度進(jìn)行觀察;通過C反應(yīng)蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)及補(bǔ)體C3沉積實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)菌磷壁酸合成量改變,并進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞壁原生質(zhì)及細(xì)胞壁壁進(jìn)行分離,通過western blot確證野生菌與缺陷菌壁磷壁酸(WTA)及脂磷壁酸(LTA)合成量變化情況。通過增加Mg~(2+)濃度改變培養(yǎng)基滲透壓,觀察野生菌與缺陷菌對(duì)高滲環(huán)境的耐受能力。用小鼠毒力實(shí)驗(yàn)比較spd1672缺陷菌與野生菌的毒力改變;并通過體內(nèi)定植實(shí)驗(yàn)、殺菌實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子測定等研究方法,對(duì)spd1672影響肺炎鏈球菌毒力的機(jī)制進(jìn)行初步探討。 結(jié)果D39△1672較D39在體外培養(yǎng)條件下生長能力減弱,通過透視電子顯微鏡觀察,D39△1672與D39莢膜厚度并無明顯改變。C反應(yīng)蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示D39△1 672結(jié)合CRP量較D39明顯減少。而補(bǔ)體C3沉積實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示D39△1672結(jié)合補(bǔ)體C3量較D39明顯減少。進(jìn)一步利用抗磷壁酸抗體對(duì)兩種細(xì)菌磷壁酸合成量進(jìn)行western blot分析后發(fā)現(xiàn),D39△1672較D39菌WTA和LTA合成量菌明顯減少。改變生長培養(yǎng)基的離子濃度后發(fā)現(xiàn),在加入50mM Mg~(2+)條件下,D39△1672的增殖速率較正常培養(yǎng)基中明顯提高(P0.05),而對(duì)D39并無明顯影響,而在100mM、200mM Mg~(2+)條件下,D39△1672的增殖受到顯著抑制(P0.05),而D39僅受輕微影響(P0.05)。通過腹腔途徑感染小鼠,結(jié)果顯示D39△1672毒力較D39菌明顯減弱,其感染小鼠后入血菌量較D39明顯減少(P0.05),在鼻咽部、肺部定植數(shù)也較D39顯著減少(P0.05)。全血?dú)⒕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示D39△1 672對(duì)白細(xì)胞的殺菌作用抵抗力較D39顯著減弱(P0.05)。通過對(duì)細(xì)胞因子測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)D39感染的小鼠較D39△1 672誘導(dǎo)更高水平的IL12、TNF-α。 結(jié)論通過本研究顯示spd1672基因是影響磷壁酸合成的關(guān)鍵基因,該基因缺失后,會(huì)引起細(xì)菌磷壁酸合成顯著減少。同時(shí)該基因缺陷后,細(xì)菌生長增殖能力減弱;對(duì)宿主定植、侵襲能力減弱;對(duì)白細(xì)胞殺菌效應(yīng)的抵抗力減弱;并對(duì)Mg~(2+)滲透壓等外界環(huán)境改變更為敏感,提示該基因是細(xì)菌感染致病過程中的一個(gè)重要的毒力因子。
[Abstract]:Background in our earlier work, some induced genes were screened from Streptococcus pneumoniae. These induced genes may be related to bacterial infection. SPD1672 gene is one of them, which is analyzed by bioinformatics. The expression product SPD1672 contained the ligase domain of lipid A core-O antigen, suggesting that this gene may be related to the formation of bacterial cell wall polysaccharides. The purpose of this study is to identify the function of spd1672 gene. To explore the biological evidence of its influence on cell wall polysaccharide synthesis and to further study its virulence mechanism in the process of infection. Methods spd1672 gene deficient bacteria of Streptococcus pneumoniae (D39 1672) were constructed by the method of gene replacement inactivation, and the thickness of the capsule was observed by transmission electron microscope (TEM). C-reactive protein binding assay and complement C3 deposition were used to observe the changes of phosphatidic acid synthesis, and the protoplasm and cell wall of cell wall were further separated. Western blot was used to confirm the changes of the amount of phosphatidic acid (WTA) and phosphatidic acid (LTA) in the wall of wild and defective bacteria. The tolerance of wild and defective bacteria to hyperosmotic environment was observed by increasing the concentration of Mg2 and changing the osmotic pressure of culture medium. The virulence changes of spd1672 deficient bacteria and wild bacteria were compared with mice virulence test, and the mechanism of spd1672 affecting the virulence of Streptococcus pneumoniae was preliminarily discussed by means of colonization experiment, bactericidal test and cytokine determination in vivo. Results the growth ability of D39 1672 was weaker than that of D39 in vitro. The thickness of D39 1672 and D39 capsule did not change obviously. The results showed that the amount of D39 1 672 binding CRP was significantly lower than that of D39. The results of C _ 3 deposition showed that C _ 3 content of D _ 39 1672 was significantly lower than that of D _ (39). The results of western blot analysis showed that D39 1672 was significantly lower than that of D39 strain. After changing the ion concentration of the growth medium, it was found that the proliferation rate of D39 1672 was significantly higher than that of the normal medium under the condition of 50 mm mg ~ (2) addition (P0.05), but had no obvious effect on D39. The proliferation of D39 1672 was significantly inhibited (P0.05) under 100mM ~ (2) mg ~ (2), while D39 was only slightly affected (P0.05). The results showed that the virulence of D39 1672 was significantly lower than that of D39, and the amount of blood bacteria in infected mice was significantly lower than that of D39 (P0.05), and the number of lung colonization in nasopharynx was significantly lower than that in D39 (P0.05). The results of whole blood germicidal test showed that the bactericidal resistance of D391,672 to leukocytes was significantly lower than that of D39 (P0.05). The results showed that the level of IL-12 TNF- 偽 in D39 infected mice was higher than that in D39 1,672 mice. Conclusion this study shows that spd1672 gene is the key gene affecting the phosphoric acid synthesis, and the deletion of the gene will cause a significant decrease in the phosphoric acid synthesis of bacteria. At the same time, the ability of bacteria growth and proliferation was weakened, the ability of invasiveness to host was weakened, the resistance to leukocyte bactericidal effect was weakened, and was more sensitive to the change of mg ~ (2) osmotic pressure. It is suggested that this gene is an important virulence factor in the pathogenic process of bacterial infection.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378.14

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本文編號(hào)：2053291