本文選題：HCV + 核心蛋白　； 參考：《昆明理工大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是一種RNA病毒,主要為血液傳播,可造成急、慢性病毒性肝炎,并導(dǎo)致慢性進行性肝炎、肝硬化(Hepatocellular cirrhosis, HC和肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)。全球約有1.7-2億人感染HCV,中國有近4千萬人感染HCV,屬于HCV流行比較嚴重的國家之一。由于尚無預(yù)防性疫苗和有效治愈的藥物,對HCV進行早期診斷,對控制其傳播就顯得尤為重要。目前HCV檢測技術(shù)主要包括抗體檢測、核酸檢測、核心抗原檢測。HCV抗體檢測一般存在7-10周的窗口期,且病毒有6種主要的基因型和超過50種亞型易造成漏檢。HCV核酸檢測雖然能有效的縮短窗口期,但因RT-PCR操作復(fù)雜,容易污染且價格昂貴,使之不能廣泛應(yīng)用。HCV核心抗原感染后2-3天就能檢測到,有效的縮短了窗口期,但核心抗原在血液里的含量極其低,高靈敏度檢測天然HCV core抗原的匹配抗體是建立HCV core抗原診斷試劑的關(guān)鍵和難點。鑒于此,本研究的目的在于表達并純化HCV core蛋白,并制備出高效價的抗體,以期望能夠用于建立高靈敏度HCV core抗原診斷試劑盒。 我們通過對HCV core蛋白基因序列的分析,發(fā)現(xiàn)HCV Core蛋白N端的前120個左右氨基酸構(gòu)成了主要的親水結(jié)構(gòu)域,這段也幾乎包括了HCV Core蛋白的所有保守性B細胞表位,而C端富含疏水性氨基酸不利于表達和純化。因此,研究選擇HCV core蛋白125aa (HCV core125)作為目的蛋白,以期獲得高的表達量并能夠產(chǎn)生高效價的抗體。首先設(shè)計1b基因型特異性引物,對HCV核心蛋白前375bp (125aa)的基因片段進行擴增,將Core125基因片段克隆到PET28a表達質(zhì)粒,成功地構(gòu)建了重組表達載體PET28a-Core125。重組原核表達菌在1.Omm IPTG進行誘導(dǎo)下,Core125蛋白(21kD左右)得到了大量的表達,主要以包涵體的形式存在。Ni2+-NTA親和層析柱純化的包涵體Core125蛋白,分子量大小約為21kD,與預(yù)期結(jié)果一致,但存在分子量約為30kD的雜蛋白,再經(jīng)過Strep-Tactin系統(tǒng)親和層析純化后,得到高純度目的蛋白。以感染不同基因型HCV的病人血漿為結(jié)合抗體,對純化后的Core125蛋白經(jīng)過Western blot檢測,結(jié)果顯示純化的Core125蛋白能夠與HCV幾種基因型和亞型(la,lb,3a,3b,6a,6n,6u)病人血清反應(yīng),說明此蛋白具有良好的抗原性及基因型間檢測通用性。 用Core125蛋白免疫新西蘭大白兔,以間接ELISA法檢測產(chǎn)生的多克隆抗體血清效價達到1：1024000。多克隆抗體血清經(jīng)過Western blot鑒定,顯示了其具有很好的特異性。用Core125蛋白免疫BALB/C小鼠后,以間接ELISA檢測血清效價達到1：51200,顯示獲得了很好的免疫效果,可作為篩選獲得陽性雜交瘤細胞的B細胞供體。但由于單克隆抗體的制備中細胞融合率較低,未能成功制備單抗。 本論文成功表達了截短型的HCV核心蛋白(Core125),獲得了高純度的目的蛋白,純化的Core125蛋白能夠與不同HCV基因型病人血清反應(yīng),顯示了此蛋白具有良好的抗原性及基因型間檢測通用性；制備出的Core125蛋白多克隆抗體具有高的效價,為HCV抗原檢測提高其靈敏度的研究奠定了基礎(chǔ)；另外,本研究獲得Core125蛋白的多克隆抗體,并初步進行小鼠免疫以獲得陽性雜交瘤細胞,為制備Core125蛋白的單克隆抗體做了準備工作,為HCV核心抗原檢測試劑的開發(fā)奠定了前期工作基礎(chǔ)。
[Abstract]:Hepatitis C virus (Hepatitis C virus, HCV) is a RNA virus, mainly for blood transmission, can cause acute, chronic viral hepatitis, and lead to chronic progressive hepatitis, liver cirrhosis (Hepatocellular cirrhosis, HC and hepatocellular carcinoma (Hepatocellular carcinoma, HCC). There are about 40 million people in the world, and nearly 40 million people in China are infected, " HCV is one of the most popular countries. Because there is no preventive vaccine and effective cure, the early diagnosis of HCV is very important to control its transmission. At present, HCV detection technology mainly includes antibody detection, nucleic acid detection, and core antigen detection of.HCV antibody detection generally has 7-10 weeks window period, and the virus has 6 The main genotypes and more than 50 subtypes can easily lead to a leak detection.HCV nucleic acid detection, although it can effectively shorten the window period, but because of the complexity of the RT-PCR operation, easy pollution and high price, it can not be detected at 2-3 days after the widespread application of.HCV core antigen infection, effectively shortening the window period, but the core antigen in the blood content extremely It is the key and difficult point to detect the matched antibody of natural HCV core antigen with low and high sensitivity. In view of this, the purpose of this study is to express and purify the HCV core protein and prepare the high efficient antibody, so as to be expected to be used for the establishment of a high sensitivity HCV core antigen diagnostic kit.
By analyzing the sequence of the HCV core protein gene, we found that the first 120 amino acids of the N terminal of the Core protein form the main hydrophilic domain. This segment also almost includes all the conserved B cell epitopes of the HCV Core protein, and the C terminal rich in hydrophobic amino acids is not beneficial to the epitope and purification of the B. Therefore, the HCV core protein 125A is studied. A (HCV core125) is used as the target protein to obtain high expression and produce high effective antibody. First, the specific primers of 1B genotype were designed to amplify the gene fragment of 375bp (125aa) before the core protein of HCV, and the Core125 gene fragment was cloned into the PET28a expression plasmid, and the recombinant expression vector PET28a-Core125. was successfully constructed. The Recombinant Prokaryotic Expression bacteria were induced by 1.Omm IPTG, and the Core125 protein (21kD) was expressed in a large amount. The inclusion body Core125 protein was purified mainly in the form of inclusion body. The molecular weight was about 21kD, which was consistent with the expected result, but there was a protein with a molecular weight of about 30kD, and then through Strep-Tactin. High purity target protein was obtained after purification by system affinity chromatography. The plasma of infected patients with different genotype HCV was combined with antibody, and the purified Core125 protein was detected by Western blot. The results showed that the purified Core125 protein could react with the sera of several HCV genotypes and subtypes of HCV (LA, LB, 3a, 3b, 6a, 6N, and 6N). Good antigenicity and genotypes are used to detect generality.
Core125 protein was used to immunize New Zealand white rabbits. The serum titer of polyclonal antibody was detected by indirect ELISA method. The serum titer of 1:1024000. polyclonal antibody was identified by Western blot. It showed that the serum titer was good specificity. After immunizing BALB/C mice with Core125 protein, the serum titer of indirect ELISA was reached to 1:51200. Good immune effect can be used as a B cell donor for screening positive hybridoma cells. However, the McAb has not been successfully prepared because of low cell fusion rate in the preparation of monoclonal antibodies.
In this paper, a truncated HCV core protein (Core125) was successfully expressed and a highly purified target protein was obtained. The purified Core125 protein could react with the sera of different HCV genotypes, showing that the protein has good antigenicity and generality between genotypes, and the prepared Core125 protein polyclonal antibody has high potency. The study laid the foundation for the study of HCV antigen detection to improve its sensitivity. In addition, this study obtained the polyclonal antibody of Core125 protein and preliminarily immunized the mice to obtain positive hybridoma cells, prepared the monoclonal antibody for the preparation of Core125 protein, and laid a preliminary working basis for the development of the HCV core antigen detection reagent. Foundation.
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R373.21

【共引文獻】

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6 朱云鴻;姚文虎;魏洪霞;;紅景天甙對HIV感染者外周血CD4+T細胞凋亡的影響[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會防治艾滋病分會第八次年會論文集[C];2011年

7 雒國彬;謝鳳研;王志博;齊欣;范春玲;張永根;;酵母硒對圍產(chǎn)前期奶牛免疫性能的影響[A];首屆中國奶業(yè)大會論文集(上冊)[C];2010年

8 方美玉;任瑞文;劉建偉;;我國甲病毒的研究進展及其預(yù)防[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點研討會論文集[C];2009年

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本文編號：2040445