本文選題：B7-H4 + 單克隆抗體　； 參考：《蘇州大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：B7-H4(B7x, B7S1)是B7家族的新成員，可以通過抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生及阻遏細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。人B7-H4位于1號染色體上，cDNA長約1.8kb，在基因組上跨越66kb，含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，編碼282個(gè)氨基酸，屬于免疫球蛋白超家族。人B7-H4分子的mRNA在淋巴和非淋巴組織中都有表達(dá)，但免疫組化顯示，B7-H4蛋白僅在部分正常組織中微弱表達(dá)。近年來許多研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)B7-H4蛋白在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌等，，這提示了B7-H4分子可能在腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊中發(fā)揮一定的作用，此外B7-H4在維持機(jī)體免疫耐受過程中也起到重要的作用。因此，B7-H4分子的作用為腫瘤、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)等疾病提供了新的治療思路。阻斷B7-H4分子與其受體的相互作用，有望成為干預(yù)自身免疫性疾病和腫瘤生物治療的潛在靶點(diǎn)。制備特異性鼠抗人B7-H4單克隆抗體及研制特異、靈敏、穩(wěn)定的人可溶性B7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒，為進(jìn)一步研究B7-H4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供了有力的工具，同時(shí)也為臨床相關(guān)疾病的診斷、治療提供了新的手段。 一、鼠抗人B7-H4單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性的初步研究 【目的】制備鼠抗人B7-H4的單克隆抗體（mAb）并對其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。 【方法】以本室構(gòu)建的穩(wěn)定高表達(dá)B7-H4分子的L929/B7-H4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為免疫原，免疫6~8周齡的BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合后，采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）篩選陽性克隆，制備穩(wěn)定分泌抗B7-H4mAb的細(xì)胞株，用快速試紙法鑒定mAb的Ig亞類，并采用Western blot、Dot blot、位點(diǎn)競爭抑制實(shí)驗(yàn)和T細(xì)胞增殖抑制阻斷實(shí)驗(yàn)對所獲的mAb進(jìn)行鑒定。 【結(jié)果】成功獲得3株穩(wěn)定分泌抗人B7-H4mAb的陽性克隆，分別命名為5C8、5G3、8F10�？焖僭嚰埛ㄨb定5C8為IgG2a類、5G3和8F10均為IgG1類。Western blot和Dot blot結(jié)果表明：5C8、5G3、8F10均能與人B7-H4蛋白特異性結(jié)合；位點(diǎn)競爭實(shí)驗(yàn)顯示（1）：3株單抗與商品化單抗H74結(jié)合在不同位點(diǎn)；（2）：與本室已有的2株單抗1F10和2B2位點(diǎn)競爭結(jié)果為：3株單抗與1F10結(jié)合在不同位點(diǎn)；5C8和5G3與2B2識(shí)別位點(diǎn)可能相近，8F10與單抗2B2結(jié)合在不同位點(diǎn)；（3）：這3株單抗相互位點(diǎn)競爭結(jié)果為：5C8與5G3結(jié)合在不同位點(diǎn)；8F10與5C8和5G3識(shí)別位點(diǎn)可能相近。T細(xì)胞增殖抑制阻斷實(shí)驗(yàn)顯示，這3株單抗均能阻斷B7-H4分子對T細(xì)胞增殖抑制作用。 【結(jié)論】成功獲得3株鼠抗人B7-H4單克隆抗體，為研究B7-H4分子在腫瘤中的作用提供了手段。 二、可溶性B7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒的研制 【目的】建立人可溶性B7-H4（sB7-H4）酶聯(lián)檢測試劑盒。 【方法】以本研究已獲得的3株單抗（5C8、5G3、8F10）和本室已獲得的另外2株鼠抗人B7-H4單抗（1F10、2B2）為基礎(chǔ)，采用單抗1F10作為包被抗體，以標(biāo)記生物素(biotin)的單抗8F10作為檢測抗體，建立雙單抗夾心的人可溶性B7-H4（sB7-H4）酶標(biāo)檢測方法，并對正常人外周血血清中的sB7-H4含量進(jìn)行了檢測。 【結(jié)果】成功研制了人sB7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒，其靈敏度為3.13ng/mL。該試劑盒4℃放置1個(gè)月，離散度(CV%)±2.80，回收率為92.98%~107.4%，提示該檢測試劑盒具有良好的靈敏度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。用該試劑盒測得正常人血清中sB7-H4的正常值為40.00±11.93ng/mL。 【結(jié)論】成功研制了檢測人sB7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒。 綜上所述，成功獲得3株能穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-H4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并研制了檢測人sB7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒。為進(jìn)一步研究B7-H4分子生物學(xué)功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[Abstract]:B7 - H4 ( B7 - H4 ) is a new member of B7 family . B7 - H4 molecule plays an important role in inhibiting T cell proliferation , cytokine production and cell cycle progression .

Preparation of monoclonal antibody against human B7 - H4 and its biological characteristics

Objective To prepare the monoclonal antibody ( mAb ) of murine B7 - H4 against human B7 - H4 and to identify its biological characteristics .

BALB / c mice immunized with B7 - H4 were transfected into BALB / c mice immunized with B7 - H4 molecules . After fusion with SP2 / 0 mouse myeloma cells ( SP2 / 0 ) , the positive clones were screened by flow cytometry ( FCM ) . The Ig subclass of mAb was identified by rapid test paper . Western blot , dot blot , site competition inhibition assay and T cell proliferation inhibition test were used to identify the mAb .

The positive clones were identified as 5C8 , 5G3 and 8F10 , respectively . The results showed that 5C8 , 5G3 and 8F10 were IgG1 . Western blot and Dot blot showed that both 5C8 , 5G3 and 8F10 could bind to human B7 - H4 protein .
The site competition experiment showed that : ( 1 ) Three monoclonal antibodies were combined with commercial monoclone antibody H74 at different sites ;
( 2 ) The results were as follows : 3 monoclonal antibodies and 1F10 were bound to different sites ;
5C8 and 5G3 may be similar to the 2B2 identification sites , and 8F10 and 2B2 bind to different sites ;
( 3 ) The competitive results of these three isolates were : 5C8 and 5G3 bound at different sites ;
8F10 was similar to 5C8 and 5G3 recognition sites . T cell proliferation inhibition block experiment showed that these three monoclonal antibodies could block the inhibition of B7 - H4 molecule on T cell proliferation .

Conclusion The monoclonal antibodies against B7 - H4 have been successfully obtained in three murine anti - human B7 - H4 molecules , which provide a means to study the role of B7 - H4 molecules in tumors .

Development of Soluble B7 - H4 ELISA Kit

Objective To establish a human soluble B7 - H4 ( sB7 - H4 ) ELISA kit .

Based on three monoclonal antibodies ( 5C8 , 5G3 , 8F10 ) and another two mouse anti - human B7 - H4 monoclonal antibodies ( 1F10 , 2B2 ) which have been obtained in this study , monoclonal antibody 1F10 was used as the antibody to detect the antibody , biotin - labeled monoclonal antibody 8F10 was used as the detection antibody , and the detection method of human soluble B7 - H4 ( sB7 - H4 ) was established , and the levels of sB7 - H4 in serum of human peripheral blood were detected .

The sensitivity of the kit was 3.13ng / mL . The sensitivity was 3.13ng / mL . The results showed that the detection kit had good sensitivity , stability and accuracy . The normal value of sB7 - H4 in human serum was 40.00 鹵 11.93ng / mL .

Conclusion The ELISA kit for detecting human sB7 - H4 was successfully developed .

In conclusion , three hybridoma cell strains capable of stably secreting anti - human B7 - H4 monoclonal antibodies against human B7 - H4 were successfully obtained , and a kit for detecting human sB7 - H4 was developed .
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：2035572