發(fā)布時(shí)間：2018-06-16 15:33

  本文選題：雞蛋 + 雞卵黃免疫球蛋白　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：雞卵黃免疫球蛋白,簡稱IgY (chicken egg yolk immunoglobulin),又稱雞卵黃抗體,是由血液中IgG被選擇性地轉(zhuǎn)移到卵黃中唯一的免疫球蛋白類。由于IgY是蛋白質(zhì)類大分子,具有一定的免疫原性,當(dāng)其用于機(jī)體時(shí),會(huì)引發(fā)抗體產(chǎn)生而降低療效,并且易受溫度、酸堿、酶的影響,從而限制了IgY的應(yīng)用領(lǐng)域。本文針對這一問題,制備了mPEG化IgY,主要研究內(nèi)容為：雞IgY分離純化,nPEG化學(xué)修飾,以及修飾前后的IgY穩(wěn)定性進(jìn)行對比研究。研究結(jié)果如下： 1.建立了一種高效、經(jīng)濟(jì)、大規(guī)模分離純化雞卵黃免疫球蛋白(IgY)的生產(chǎn)方法,即在對傳統(tǒng)水稀釋法改良的基礎(chǔ)上,結(jié)合聚乙二醇沉淀與離子交換色譜進(jìn)行IgY的分離純化。具體工藝為新鮮雞蛋經(jīng)過分離得到蛋黃液,經(jīng)水稀釋后,離心得上清液,向上清液中加入PEG6000沉淀蛋白,沉淀物經(jīng)透析、冷凍干燥之后經(jīng)過一步離子交換法進(jìn)行純化,并對具體工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用8倍無菌水稀釋蛋黃液,用0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為5.2,在4℃下靜置8h,于5000×g力離心可得上清粗IgY,經(jīng)測定回收率可達(dá)93.47%。然后用6%聚乙二醇沉淀后經(jīng)DEAE-Toyopearl650M離子交換純化,最佳的純化條件：0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7)平衡上樣,0.075mol/L PBS (pH7)洗脫。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析結(jié)果顯示所得的IgY的純度為95%,活性保持率高達(dá)73.77%。本研究彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分離方法不能同時(shí)達(dá)到高純度和高回收率的缺點(diǎn),且可用于大規(guī)模生產(chǎn)。 2.研究了單甲氧基聚乙二醇(mPEG)對雞卵黃免疫球蛋白(IgY)的化學(xué)修飾,并通過傅里葉變換紅外光譜、圓二色光譜和熒光光譜分析比較了修飾前后IgY的穩(wěn)定性。具體修飾方法為：mPEG經(jīng)NHS活化,得NHS-mPEG,冷凍干燥,NHS-mPEG對IgY進(jìn)行化學(xué)修飾,得iPEG-IgY。 mPEG對IgY進(jìn)行修飾過程中,通過對各種修飾條件的摸索和比較優(yōu)化,最后篩選出mPEG最佳修飾反應(yīng)條件為：IgY與活化后的nPEG按摩爾比1：10,pH7條件下反應(yīng)1h可得修飾率為20.56%的mPEG-IgY,IgY活性保持率可達(dá)90%。修飾前的IgY二級結(jié)構(gòu)中a-Helix、β-sheet、β-Turn、Random分別為14.5%、42.1%、6.2%、37.2%；修飾后的mPEG-IgY各二級結(jié)構(gòu)含量分別為9.1%、44.9%、7.4%、38.6%。與修飾前相比,nPEG-IgY的α-螺旋含量降低了約37%,p-螺旋含量升高,其他含量變化不明顯。 3.通過光譜分析法對IgY以及mPEG-IgY的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,70℃溫育120min后,IgY的α-Helix、β-sheet、β-Turn、Random各二級結(jié)構(gòu)含量由14.5%、42.1%、6.2%、37.2%變?yōu)?.6%、55.25%、5.8%、37.5%；mPEG-IgY的各二級結(jié)構(gòu)含量由12.9%、42.7%、6.3%、38.1%變?yōu)?.1%、50.5%、7.2%、39.2%。熱動(dòng)力學(xué)分析表明,IgY熱變性反應(yīng)級數(shù)為1級,在65、70、75、80、85、90℃加熱條件下,D值分別為：166.67、37.59、6.48、2.92、1.79、1.13min；此溫度范圍內(nèi)的Z值為11.5℃,表觀活化能Ea=200.841kJ/mol,焓值分別為198.0296、197.988、197.9465、197.9049、197.8633、197.8218kJ/mol,熵值分別為58.66751、58.65283、58.63837、58.62411、58.59619kJ/(mol·K),吉普斯自由能分別為33.09298、30.65444、28.2166、25.77931、23.34261、20.90646kJ/mo。 mPEG-IgY熱變性反應(yīng)級數(shù)為1級,在65、70、75、80、85、90℃加熱條件下,D值分別為：208.33、60.61、8.02、4.48、2.50、2.18min;此溫度范圍內(nèi)的Z值為12.22℃,表觀活化能Ea=186.915kJ/mol,焓值分別為84.1036、184.0621、184.0205、183.9789、183.9373、183.5958kJ/mol,熵值分別為53.50651、53.49183、53.47737、53.62411、58.61005、58.59619kJ/(mol·K),吉普斯自由能分別為33.67654、31.45257、29.2292、27.00644、24.78425、22.26271kJ/mol。 4.對IgY以及mPEG-IgY不同酸堿條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,在4h、pH11條件下：nPEG-IgY活性保持率比IgY活性保持率高接近五倍。圓二色光譜掃描分析顯示,在pH4處理?xiàng)l件下,IgY的α螺旋含量降低了76.4%,而修飾后的IgY降幅減少15.7%；IgY以及mPEG-IgY的β折疊含量均有所增高,增幅分別為18.4%和29.7%。在pH11條件下圓二色光譜掃描結(jié)果為IgY的α螺旋含量降低了71.1%,而修飾后的IgY降幅減少14.9%；IgY以及mPEG-IgY的β折疊含量均有所增高,增幅分別為16.5%和21.7%。說明IgY經(jīng)過mPEG修飾以后所得產(chǎn)物對酸堿有著更高的耐受力。 5.對IgY以及nPEG-IgY在模擬胃腸液消化系統(tǒng)中的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,在pH4的模擬胃液消化過程中,反應(yīng)30～45min時(shí)間段內(nèi),IgY活性保持率由83.57%變?yōu)?5.59%,活性降低28.08%；mPEG-IgY活性保持率由89.81%變?yōu)?2.63%,活性降低17.18%。反應(yīng)90～120min時(shí)間段內(nèi),IgY活性保持率由46.24%變?yōu)?1.33%,活性降低14.91%；mPEG-IgY活性保持率由63.21%變?yōu)?0.44%,活性降低2.77%。pH2條件下,對比IgY以及mPEG-IgY活性保持率可以發(fā)現(xiàn),反應(yīng)30～45min時(shí)間段內(nèi),IgY活性保持率由71.69%變?yōu)?0.37%,活性降低21.32%；mPEG-IgY活性保持率由83.33%變?yōu)?5.25%,活性降低18.08%。反應(yīng)90～120min時(shí)間段內(nèi),IgY活性保持率由41.36%變?yōu)?0.69%,活性降低20.67%；mPEG-IgY活性保持率由55.49%變?yōu)?9.82%,活性降低5.67%。氨基酸成分分析結(jié)果顯示,修飾前以及修飾后的IgY,氨基酸成分以及含量基本一致,說明IgY在經(jīng)過nPEG修飾之后一級結(jié)構(gòu)并沒有被破壞。寡肽成分分析結(jié)果表明,經(jīng)消化液酶解后,mPEG-IgY寡肽的種類和數(shù)量減少,說明經(jīng)IgY過修飾后比修飾前有著更強(qiáng)的胃蛋白酶、胰蛋白酶穩(wěn)定性。因此可知經(jīng)過修飾后的IgY比沒有修飾的天然IgY有著更強(qiáng)的胃蛋白酶、胰蛋白酶穩(wěn)定性。
[Abstract]:Chicken egg yolk immune globulin , also known as chicken egg yolk antibody , is the only immunoglobulin class which is selectively transferred from blood to egg yolk .

1 . An efficient , economical and large - scale separation and purification of egg yolk immune globulin ( igy ) was established . The separation and purification were carried out on the basis of the improvement of traditional water dilution method . The specific process was that fresh eggs were separated to obtain egg yolk liquid . After being diluted with water , the supernatant was purified by one - step ion exchange method . The results showed that the purity of the obtained igy was 95 % and the activity retention rate was 73.77 % . The results showed that the traditional separation method could not achieve the defects of high purity and high recovery rate , and could be used for mass production .

2 . The chemical modification of egg yolk immunoglobulin by single methoxy polyethylene glycol ( mPEG ) was studied . The stability of the modified igy was compared by FTIR , circular dichroism and fluorescence spectrum analysis .
The content of the secondary structures of the modified mPEG - igy was 9.1 % , 44.9 % , 7.4 % and 38.6 % , respectively .

3 . The thermal stability of igy and mPEG - gy was studied by spectral analysis . The results showed that after incubation for 120 min at 70 鈩，

本文編號：2027180