發(fā)布時間：2018-06-13 21:34

  本文選題：銅綠假單胞菌 + 氨基糖苷類耐藥性��； 參考：《南開大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，，PA)，又稱綠膿桿菌，廣泛分布于自然界、人體的皮膚、腸道和上呼吸道中。銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，也是引起嚴(yán)重的醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的常見病原菌之一。該菌也常引發(fā)慢性支氣管炎及囊性纖維化繼發(fā)感染等疾病，是嚴(yán)重?zé)齻�、�?chuàng)傷感染病人，囊性纖維化病人及晚期腫瘤患者死亡的重要原因之一，嚴(yán)重危害著人類的健康和生命。隨著臨床抗生素藥物應(yīng)用的日益廣泛，多耐藥銅綠假單胞菌的出現(xiàn),給醫(yī)院有效的抗感染治療帶來極大的困擾。因此，對其耐藥機(jī)理的研究對于預(yù)防和治療由銅綠假單胞菌引起的感染有重要的意義。 本文以一株卡那霉素敏感的臨床分離株P(guān). aeruginosa PA68為出發(fā)菌株，應(yīng)用人工Mu轉(zhuǎn)座復(fù)合物技術(shù)建立突變子庫，從中篩選出一株對鏈霉素耐藥性明顯增強(qiáng)的菌株，命名為M122，通過基因克隆、核苷酸序列測定及分析，確定基因組上的Mu插入失活位點(diǎn)為PA0058基因的第214bp處，在Pseudomonasaeruginosa基因組數(shù)據(jù)庫(www. pseudomonas.com)中，PA0058基因被定義為一個功能未知的，和已報道的基因沒有同源性的新基因。本文以這個新基因?yàn)檠芯繉ο�，通過大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對PA0058基因的功能進(jìn)行了系統(tǒng)、深入的探討，并首次將其命名為dsbM基因。 對dsbM突變株M122的表型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其對多種氨基糖苷類抗生素的耐藥性都得到增強(qiáng)。通過同源重組實(shí)驗(yàn)，在模式菌株P(guān). aeruginosa PAK中敲除dsbM基因,得到的基因敲除株具有鏈霉素耐藥性增高的表型，與Mu插入突變株M122一致，證實(shí)了dsbM基因在模式菌株中同樣能夠影響氨基糖苷類抗生素的耐藥性。通過導(dǎo)入攜帶完整dsbM基因的表達(dá)載體可以使突變株M122對鏈霉素和慶大霉素的耐藥性有所降低，表型部分回復(fù)至野生型水平。 本文中在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了dsbM基因，并對其表達(dá)產(chǎn)物DsbM蛋白進(jìn)行了酶學(xué)活性的分析。發(fā)現(xiàn)DsbM蛋白能夠催化二硫鍵的氧化、還原和異構(gòu)，是一種新型的二硫鍵氧化還原酶。通過DNA微陣列技術(shù)得到了突變株M122的基因表達(dá)譜，與相同背景的野生型PA68菌株對比分析發(fā)現(xiàn)，dsbM基因的失活能夠影響全基因組的表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物DsbM可能是一個作用范圍廣泛的，具有重要功能的蛋白質(zhì)。在表達(dá)量發(fā)生變化的基因中，參與主動運(yùn)輸、能量代謝功能的基因最多，并發(fā)現(xiàn)突變株中由于dsbM基因的失活，促使多種抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增高，其中包括oxyR調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控的katB, ahpB和ahpCF。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)DsbM蛋白與OxyR蛋白之間存在相互作用。 本文推測，二硫鍵氧化還原酶DsbM是通過OxyR抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)影響氨基糖苷類抗生素耐藥性的。通過對銅綠假單胞菌耐藥性相關(guān)基因的研究，能夠更深入的認(rèn)識細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理和代謝途徑，為新藥物的設(shè)計(jì)和研發(fā)提供理論依據(jù)，最終能針對性地設(shè)計(jì)藥物用以治療和抑制銅綠假單胞菌所引發(fā)的感染。
[Abstract]:Pseudomonas aeruginosaformis, also known as Pseudomonas aeruginosa, is widely distributed in nature, human skin, intestinal tract and upper respiratory tract. Pseudomonas aeruginosa is an important conditional pathogen and one of the common pathogens causing severe nosocomial infection. The bacteria often cause chronic bronchitis and secondary infection of cystic fibrosis, which is one of the important causes of death in patients with severe burn, trauma infection, cystic fibrosis and advanced tumor, which seriously endangers the health and life of human beings. With the increasing application of antibiotic drugs, the emergence of multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa has brought great problems to the effective anti-infective treatment in hospitals. Therefore, it is important to study the mechanism of drug resistance in the prevention and treatment of infection caused by Pseudomonas aeruginosa. In this paper, a kanamycin sensitive clinical strain, P.aeruginosa PA68, was used to establish mutants library by artificial Mu transposable complex, and a strain with significantly increased resistance to streptomycin was screened out. It was named M122. By gene cloning, nucleotide sequencing and analysis, it was determined that the inactivation site of Mu insertion in genome was the 214bp of PA0058 gene, and PA0058 gene was defined as an unknown function in Pseudomonas aeruginosa genome database (www. pseudomonas.com). A new gene with no homology with reported genes. In this paper, the function of PA0058 gene was studied systematically and deeply by a large amount of experimental data, and it was named dsbM gene for the first time. The phenotype of DSBM mutant M122 was detected and its resistance to various aminoglycoside antibiotics was increased. By homologous recombination experiment, the dsbM gene was knockout from the model strain P. aeruginosa PAK, and the knockout strain had the phenotype of increased streptomycin resistance, which was consistent with that of Mu inserted mutant M122. It was confirmed that dsbM gene could also affect the resistance of aminoglycoside antibiotics in the model strain. The resistance of the mutant M122 to streptomycin and gentamicin could be reduced by introducing the expression vector carrying the complete dsbM gene, and the phenotype was partially returned to the wild-type level. The dsbM gene was induced and expressed in Escherichia coli, and the enzymatic activity of its expression product DsbM protein was analyzed. It was found that DsbM protein can catalyze the redox, reduction and isomerization of disulfide bond. DsbM protein is a new disulfide redox enzyme. The gene expression profile of mutant M122 was obtained by DNA microarray technique. Compared with wild type PA68 strain of the same background, it was found that the inactivation of dsbM gene could affect the expression of the whole genome, and the expression product of DsbM might be a wide range of functions. A protein with important functions. The genes involved in active transport and energy metabolism function were most involved in the gene expression changes, and it was found that the gene transcription expression of many antioxidant enzymes was increased due to the inactivation of dsbM gene in the mutant. These include katb, ahpB and ahpCF. which are regulated by oxyR regulatory system. Yeast two-hybrid experiments confirmed the interaction between DsbM protein and OxyR protein. It is inferred that DsbM affects the resistance of aminoglycoside antibiotics through OxyR antioxidant regulation system. Through the study of the genes related to drug resistance of Pseudomonas aeruginosa, the mechanism and metabolic pathway of drug resistance of bacteria can be further understood, and the theoretical basis for the design and development of new drugs can be provided. Finally, targeted drugs can be designed to treat and inhibit Pseudomonas aeruginosa infection.
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378.991;Q78

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本文編號：2015499