發(fā)布時(shí)間：2018-06-13 15:20

  本文選題：神經(jīng)干細(xì)胞 + 衰老　； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的：采用在體和離體研究的技術(shù)手段，觀察不同年齡階段小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NeuralStemCells,NSCs)衰老標(biāo)志物及其增殖潛能的變化，揭示NSCs衰老進(jìn)程。并在此研究基礎(chǔ)上深入探討20S蛋白酶體及其核心亞單位PSMB1和PSMB5在NSCs衰老進(jìn)程中的調(diào)控作用，明確20S蛋白酶體活性改變對NSCs增殖能力的影響，揭示NSCs衰老機(jī)理，以期為恢復(fù)干細(xì)胞活力提供新思路。 方法：選取胚胎（Embryonicdays14,E14）、新生（Postnatalday0，P0）、成年（Postnataldays90，P90）、老年（Postnataldays540，P540）小鼠作為研究對象。1.采用SA-β-gal（senescence-associatedβ-galactosidase）染色法觀察不同年齡小鼠腦內(nèi)衰老細(xì)胞數(shù)量，判定腦老化程度；同時(shí)腹腔注射BrdU，通過BrdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測不同年齡小鼠室管膜下區(qū)（Subventricularzone,SVZ）NSCs增殖潛能。2.體外分離培養(yǎng)源自不同年齡小鼠NSCs，采用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和SA-β-gal染色法，通過離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察不同年齡NSCs增殖能力及衰老標(biāo)志物的表達(dá)變化。3.應(yīng)用20S/nestin免疫熒光雙標(biāo)，檢測20S蛋白酶體在NSCs的表達(dá)。4.應(yīng)用熒光分光光度法檢測源自不同年齡階段NSCs20S蛋白酶體活性。5.提取源自不同年齡小鼠NSCs總RNA，采用SYBRGreenReal-timePCR方法在基因水平定量分析20S蛋白酶體核心亞單位PSMB1和PSMB5的表達(dá)變化。6.應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132作用于體外培養(yǎng)NSCs，通過BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和CCK-8法檢測不同濃度MG132對NSCs增殖潛能的影響。 結(jié)果：1.SA-β-gal染色結(jié)果顯示，P90和P540小鼠SVZ腦區(qū)周圍可見大量胞漿呈藍(lán)色著色的SA-β-gal陽性衰老細(xì)胞，而E14和P0小鼠SVZ腦區(qū)周圍僅偶見個別SA-β-gal陽性衰老細(xì)胞，提示隨年齡增加腦內(nèi)SA-β-gal活性增強(qiáng)，衰老細(xì)胞逐漸增多。伴隨SA-β-gal活性上調(diào)，P90和P540小鼠SVZBrdU+細(xì)胞急劇減少，分別較E14小鼠減少92%和95%，BrdU+細(xì)胞散在分布于P90和P540小鼠側(cè)腦室背外側(cè)角和外側(cè)壁，表明成年期和老年期NSCs增殖潛能降低。2.體外分離培養(yǎng)源自不同年齡小鼠NSCs，P90和P540小鼠神經(jīng)球形成周期較E14和P0延長，BrdU陽性率分別為4.1%±0.4%和8.4%±0.9%（p0.01），較E14（38.0%±2.0%，p0.01）和P0（20.8%±1.24%，p0.01）顯著降低；SA-β-gal染色結(jié)果顯示P90與P540陽性衰老細(xì)胞明顯增多，SA-β-gal陽性率分別為26.0%±0.8%和27.6%±1.2%（p0.01），此體外研究結(jié)果進(jìn)一步表明成年期后NSCs增殖能力降低，NSCs出現(xiàn)老化現(xiàn)象。3.20S/nestin免疫熒光染色結(jié)果顯示NSCs表達(dá)20S蛋白酶體，20S蛋白酶體分布于NSCs細(xì)胞漿和細(xì)胞核。4.熒光分光光度法檢測源自不同年齡階段小鼠NSCs20S蛋白酶體活性，結(jié)果顯示P90組NSCs20S蛋白酶體活性為E14組0.8±0.2倍（p0.01），P540組NSCs20S蛋白酶體活性為E14組0.6±0.1倍（p0.001），提示成年期及老年期NSCs20S蛋白酶體活性下調(diào)。5.Real-timePCR定量分析不同年齡階段NSCs20S蛋白酶體核心亞單位PSMB1和PSMB5mRNA表達(dá)變化，其中P90組PSMB1mRNA表達(dá)水平為E14組35%±1%（p0.001），PSMB5mRNA表達(dá)水平為E14組41%±1%（p0.001）；P540組PSMB1mRNA表達(dá)水平為E14組34%±8%（p0.001），PSMB5mRNA表達(dá)水平為E14組66%±1%（p0.001），，提示成年期和老年期20S蛋白酶體核心亞單位PSMB1和PSMB5mRNA表達(dá)水平下調(diào)。6.應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132作用于體外培養(yǎng)NSCs5h，BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示0.8μMMG132能夠顯著抑制NSCs增殖能力，其BrdU陽性率較DMSO溶劑對照組減少22.7%（p0.05），并且此抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性；CCK-8檢測結(jié)果進(jìn)一步表明隨MG132濃度增加NSCs細(xì)胞活力逐步降低，20μMMG132能夠使NSCs增殖能力降低44%（p0.05），提示蛋白酶體活性下調(diào)可能是導(dǎo)致NSCs衰老進(jìn)程中細(xì)胞增殖潛能降低的重要因素。 結(jié)論：1.隨年齡增加NSCs增殖潛能降低，衰老標(biāo)志物表達(dá)水平上調(diào)，NSCs出現(xiàn)老化現(xiàn)象。 2成年和老年NSCs，20S蛋白酶體活性及其核心亞單位PMSB1和PMSB5mRNA表達(dá)水平下降，提示蛋白酶體與NSCs衰老進(jìn)程密切相關(guān)。 3.抑制蛋白酶體活性能夠顯著降低NSCs增殖能力，提示蛋白酶體參與NSCs功能維持
[Abstract]:Objective : To observe the changes of the aging marker and its proliferative potential in mouse neural stem cells in different age groups by means of the technique of somatic and ex vivo studies , to reveal the aging process .

Methods : Embryonic ( E14 ) , neonatal ( Postnatalday0 , P0 ) , adult ( Postnataldays90 , P90 ) and old age ( Postnataldays540 , P540 ) mice were studied .
5 . The effect of the inhibitor MG132 on the proliferation and the proliferation potential in vitro was detected by the use of the SYBR GreenReal - time PCR method in vitro .

Results : 1 . The results of SA - 尾 - gal staining showed that there was a large amount of blue - colored SA - 尾 - gal positive senescent cells around the SVZ brain area of P90 and P540 mice , while those of E14 and P540 mice were significantly decreased compared with those of E14 and P540 mice .
The results of SA - 尾 - gal staining showed that P90 and P540 positive aging cells were significantly increased , the positive rates of SA - 尾 - gal were 26 . 0 % 鹵 0 . 8 % and 27 . 6 % 鹵 1.2 % ( p < 0 . 01 ) .
In the P540 group , the expression level was 34 % 鹵 8 % ( p0.001 ) in E14 group and 66 % 鹵 1 % in E14 group ( p < 0.001 ) . The expression level of PSM B5mRNA was lower than that in E14 group .
The results of CCK - 8 assay further showed that the cell viability was decreased gradually with the concentration of MG132 , and 20 渭MMG132 could decrease the proliferation ability by 44 % ( p < 0.05 ) . It was suggested that the down regulation of proteasome activity could be an important factor in the decrease of cell proliferation potential in the course of aging .

Conclusion : 1 . With the increase of age , the proliferative potential is decreased , and the expression level of aging marker is up - regulated .

2 . The expression levels of PM1 and PMSB5 mRNA in adult and old - aged and old - aged cells were decreased , suggesting that the proteasome is closely related to the aging process .

3 . Inhibition of proteasome activity can significantly reduce the proliferation ability of neural stem cells , and suggest that the proteasome is involved in the functional maintenance of neural stem cells .
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2014464