本文選題：變形鏈球菌 + 缺陷株　； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2011年碩士論文

【摘要】：【目的】LuxS基因是變形鏈球菌生物膜早期形成過程中的關(guān)鍵基因,為探討變形鏈球菌LuxS基因在生物膜形成中的調(diào)控機制,本研究擬構(gòu)建該基因的缺陷株,并對該基因缺失后變形鏈球菌相關(guān)生物學性狀的改變進行初步探討。 【材料和方法】(1)采用長臂同源多聚酶鏈反應(yīng)(LFH-PCR)方法構(gòu)建含紅霉素耐藥基因片段的LuxS基因上、下游同源序列的連接片段,轉(zhuǎn)化到變形鏈球菌中,在紅霉素的平板上篩選缺陷株,并進行PCR及序列鑒定。(2)將變形鏈球菌標準菌和構(gòu)建獲得的LuxS基因缺陷株分別在BHI液體培養(yǎng)基、含2%葡萄糖的BHI液體培養(yǎng)基、含2%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基3個營養(yǎng)環(huán)境中生長,采用722S型可見光分光光度計,對細菌生長曲線的變化進行測定。(3)將變形鏈球菌LuxS基因缺陷株和標準菌在BHI液體培養(yǎng)基,含2%葡萄糖的BHI液體培養(yǎng)基,含2%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基3個營養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)24小時,通過掃描電鏡對不同營養(yǎng)環(huán)境中標準菌及LuxS基因缺陷株早期生物膜的形成差異進行比較。(4)將處于對數(shù)生長期的標準菌及缺陷株分別接種于含2%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基中形成細菌生物膜,通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù),初步分析生物膜形成初期不同時間點的可溶性蛋白表達情況。 【結(jié)果】(1)經(jīng)PCR和DNA序列測定分析證實變形鏈球菌LuxS基因缺陷菌株構(gòu)建成功。(2)在3種不同的營養(yǎng)環(huán)境中,變形鏈球菌UA159LuxS基因缺陷株的生長速度較變形鏈球菌UA159標準菌株相對略快。(3)變形鏈球菌LuxS基因缺陷株在富含蔗糖的環(huán)境中,生物膜形成能力減弱,且形成的生物膜相對疏松;而在富含葡萄糖以及不含糖的環(huán)境中,缺陷株與標準菌形成生物膜的能力差異不大。(4)對5個時間點上變形鏈球菌標準菌和LuxS缺陷株生物膜中菌體可溶性蛋白未見特異表達的蛋白條帶。 【結(jié)論】(1)本研究成功構(gòu)建出變形鏈球菌LuxS基因缺陷株,為后期針對變形鏈球菌LuxS基因的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。(2)LuxS基因缺陷后會對變形鏈球菌的生長能力產(chǎn)生影響,當環(huán)境中營養(yǎng)增加時,標準菌和缺陷株數(shù)量的最高峰值增加,并且峰值接近。(3)LuxS基因缺陷會對變型鏈球菌生物膜的形成產(chǎn)生影響,并且LuxS基因?qū)ψ冃捂溓蚓锬さ恼{(diào)控是蔗糖依賴型的。(4)在本實驗條件下使用SDS-PAGE技術(shù),結(jié)果表明,LuxS基因缺陷后,其早期生物膜形成過程中可溶性蛋白的表達量與標準菌之間未檢出明顯差異。
[Abstract]:[objective] LuxS gene is a key gene in the early biofilm formation of Streptococcus mutans. The changes of related biological characters of Streptococcus mutans after the deletion of the gene were preliminarily discussed. [materials and methods] using long arm homologous polymerase chain reaction (LFH-PCR) method, the LuxS gene containing erythromycin resistance gene fragment was constructed. The downstream homologous sequence was transformed into Streptococcus mutans, and the defective strains were screened on the erythromycin plate. PCR and sequence identification were performed. The standard strain of Streptococcus mutans and the LuxS gene deficient strain were constructed in BHI liquid medium, respectively. BHI liquid medium containing 2% glucose and BHI liquid medium containing 2% sucrose were grown in three nutrient environments. The strain and standard strain of Streptococcus mutans LuxS gene were cultured in BHI liquid medium, BHI liquid medium containing 2% glucose and BHI liquid medium containing 2% sucrose for 24 hours. The differences in the formation of early biofilm between standard bacteria and LuxS gene deficient strains in different nutrient environments were compared by scanning electron microscope (SEM). The standard bacteria and defective strains in logarithmic growth period were inoculated into BHI liquid culture containing 2% sucrose. Forming bacterial biofilm in the base, Sodium dodecyl sulfate / polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) technique was used. The expression of soluble protein at different time points in the early stage of biofilm formation was preliminarily analyzed. [results] the PCR and DNA sequencing analysis showed that Streptococcus mutans LuxS gene deficient strain was successfully constructed. The growth rate of Streptococcus mutans UA159LuxS gene deficiency strain was a little faster than that of Streptococcus mutans UA159 standard strain.) Streptococcus mutans LuxS gene defect strain decreased its biofilm formation ability in sucrose rich environment, and the biofilm formation was relatively loose. And in glucose-rich and sugar-free environments, The ability of biofilm formation between the defective strain and the standard strain was not different. 4) there were no specific expression bands of soluble protein in the biofilm of Streptococcus mutans and LuxS deficient strain at 5 time points. [conclusion] 1) The LuxS gene deficient strain of Streptococcus mutans was successfully constructed. For the later study of LuxS gene of Streptococcus mutans, the deficiency of LuxS gene will affect the growth ability of Streptococcus mutans. When the nutrition in the environment increases, the peak number of standard bacteria and defective strains increases. The peak value of LuxS gene was close to that of Streptococcus mutans biofilm formation, and the regulation of LuxS gene on Streptococcus mutans biofilm was sucrose dependent. The results showed that there was no significant difference between the expression of soluble protein in the early biofilm formation and the standard bacteria after LuxS gene deficiency.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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本文編號：2006242