本文選題：日本血吸蟲(chóng) + 成蟲(chóng)分泌代謝抗原　； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的為了尋找新的血吸蟲(chóng)免疫診斷候選抗原分子，制備了日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)分泌代謝抗原（excreted and metabolic antigens of Schistosoma japonicum, Sj-EMAs），對(duì)其抗原組分、免疫原性以及免疫反應(yīng)性進(jìn)行了初步分析。同時(shí)用該成蟲(chóng)分泌代謝抗原免疫小鼠，制備了單克隆抗體，并對(duì)此單抗的抗體亞型、在成蟲(chóng)的定位以及western-blot對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)特性分析，擬進(jìn)一步研究該單克隆抗體用于血吸蟲(chóng)病人血清循環(huán)抗原檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。方法用日本血吸蟲(chóng)尾蚴（約2000條/兔）感染家兔，，42d后處死家兔，門(mén)靜脈灌注獲得日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)，將蟲(chóng)體置無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2孵箱37℃培養(yǎng)4h，取上清得到成蟲(chóng)分泌代謝抗原；用該抗原免疫小鼠，ELISA檢測(cè)小鼠血清特異性抗體反應(yīng)；用該抗原包板，ELISA檢測(cè)血吸蟲(chóng)感染人血清抗體效價(jià)；采用十二烷基硫酸鈉聚丙酰烯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)其組分進(jìn)行分析，然后用Western-Blotting分析其對(duì)抗成蟲(chóng)分泌代謝抗原單抗（本室保存的雜交瘤細(xì)胞上清）發(fā)生反應(yīng)的蛋白條帶。另外，還用Sj-EMAs蛋白免疫小鼠6周后，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交融合，HAT篩選出雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)亞克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)，建立能穩(wěn)定分泌抗Sj-EMAs單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。并用BALB/c雌性小鼠制備單抗腹水，飽和硫酸銨粗提純后用Protein G親和層析柱純化此腹水。采用Sigma抗體亞型檢測(cè)試劑盒測(cè)定單克隆抗體的Ig類(lèi)別和亞型。用血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)冰凍切片以抗Sj-EMAs蛋白單克隆抗體的小鼠腹水作為一抗行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察2株單克隆抗體在日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的識(shí)別位點(diǎn)。用Sj-EMAs上樣做SDS-PAGE，以抗Sj-EMAs蛋白單克隆抗體的小鼠腹水作為一抗做Western-Blotting實(shí)驗(yàn)以鑒定其免疫學(xué)特性。結(jié)果成功制備日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)分泌代謝抗原；免疫小鼠可產(chǎn)生較高滴度（1:16000）抗體反應(yīng)；急性血吸蟲(chóng)病患者、慢性血吸蟲(chóng)病患者、晚期血吸蟲(chóng)病患者和鉤蟲(chóng)病患者血清抗該抗原的抗體效價(jià)分別為1：800，1：400，1：800和1：100，華支睪吸蟲(chóng)患者和正常人血清均為陰性；SDS-PAGE顯示其具有4條蛋白主要條帶，分子量分別是13、40、60和180kd左右; Western blot表明該抗原能夠被抗成蟲(chóng)分泌代謝抗原單抗在5kd左右處識(shí)別。獲得兩株特異性分泌抗Sj-EMAs單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)過(guò)體外多次傳代培養(yǎng)后，仍能分泌高效價(jià)的抗體，用BALB/c小鼠制備單抗腹水經(jīng)純化后也有較高的效價(jià)。兩株雜交瘤細(xì)胞的抗體亞型均為IgG1。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩株雜交瘤細(xì)胞抗體的識(shí)別位點(diǎn)在日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的體被表膜上。Western-Blotting證實(shí)兩株細(xì)胞均為分泌抗Sj-EMAs單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，均識(shí)別25kd左右的分泌代謝抗原。結(jié)論本研究獲得了日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)分泌代謝抗原，證實(shí)了該抗原具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性。同時(shí)獲得2株特異性分泌抗Sj-EMAs單克隆抗體的細(xì)胞株。且細(xì)胞上清和腹水中單克隆抗體的效價(jià)均較高。兩株單抗亞型均為IgG1。Western-Blotting結(jié)果證實(shí)了該2株單克隆抗體的免疫學(xué)特性，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)兩株雜交瘤細(xì)胞抗體的識(shí)別位點(diǎn)位于日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的體被表膜上。
[Abstract]:Objective In order to find a new antigen molecule for the diagnosis of Schistosoma japonicum , the antigen components , immunogenicity and immune reactivity of Schistosoma japonicum were analyzed .
immune mice were immunized with this antigen , and serum specific antibody reaction of mice was detected by ELISA ;
ELISA was used to detect the serum antibody titer of Schistosoma japonicum by using the antigen - clad plate .
A hybridoma cell line was prepared by SDS - PAGE and Western - Blotting analysis .
The immune mice can produce higher titer ( 1 : 16000 ) antibody reaction ;
The antibody titers of sera from patients with acute schistosomiasis , chronic schistosomiasis , advanced schistosomiasis and hookworm were 1 : 800 , 1 : 400 , 1 : 800 and 1 : 100 , respectively .
Western blot showed that two hybridoma cell lines secreting anti - Sj- EMAs monoclonal antibodies were able to secrete high titer antibodies .
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2004127