本文選題：甲型H1N1(2009)流感病毒 + 血凝素��； 參考：《河南工業(yè)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：甲型H1N1(2009)流感病毒基因組包含人流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒的基因片段，是多種病毒基因自然重組后形成的一種新型流感病毒。病毒的基因組是單鏈負(fù)義RNA，由8個節(jié)段組成，編碼10種蛋白質(zhì)。其中血凝素(hemagglutinin,HA)是由第四節(jié)段編碼的表面糖蛋白，是流感病毒的主要保護(hù)性抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體。因此，HA是基因工程疫苗的首選抗原，，也是流感病毒檢測的主要抗原，對流感病毒血凝素的研究有助于流感的預(yù)防控制及疫苗和診斷試劑的進(jìn)一步研究。 本研究利用甲型H1N1(2009)的HA（GenBank:GQ122097.1）全長基因序列，通過抗原表位分析、密碼子優(yōu)化、去除兩端疏水氨基酸序列來優(yōu)化基因序列，合成目的基因。將目的基因連接到表達(dá)載體pET-30Xa/LIC，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），酶切和測序鑒定。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析HA融合蛋白得到了成功表達(dá)，最佳誘導(dǎo)條件為：溫度37℃、IPTG終濃度為0.05mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間6h。融合蛋白主要以包涵體的形式存在，分子量為63kD，Western-blot鑒定表明其有良好反應(yīng)原性，通過鎳離子親和純化并復(fù)性后獲得了純度達(dá)到90%以上的重組蛋白。 用復(fù)性蛋白免疫6～8周BALB/c小鼠，將免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合，通過有限稀釋法篩選，獲得3株能夠穩(wěn)定分泌HA抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為HA-B8、HA-D1、HA-H2。制備腹水，經(jīng)純化鑒定，此三種單克隆抗體的免疫球蛋白均為IgG1，效價(jià)達(dá)到105，交叉反應(yīng)試驗(yàn)表明具有良好的特異性。 用復(fù)性蛋白免疫新西蘭大白兔，制備兔抗HA多克隆抗體，經(jīng)瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測效價(jià)達(dá)到1：32。將制備的多克隆抗體經(jīng)硫酸銨沉淀和親和層析純化，得到了較高純度抗體，經(jīng)檢測具有良好的特異性。用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記，制備酶標(biāo)抗體。 用純化單克隆抗體作為包被抗體，用標(biāo)記多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體，初步建立檢測甲型H1N1(2009)流感病毒的雙抗體夾心ELISA，實(shí)驗(yàn)表明該檢測方法對H5N1、H9N2亞型流感病毒及EV71病毒、麻疹病毒無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。 本研究在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)了HA蛋白，以重組蛋白免疫BALB/c小鼠和新西蘭大白兔分別制備單克隆抗體和多克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)初步建立了甲型H1N1(2009)流感病毒的雙抗體夾心ELISA檢測方法。
[Abstract]:The genome of influenza virus contains human influenza virus, avian influenza virus and swine flu virus. It is a new type of influenza virus formed by natural recombination of genes of many kinds of viruses. The genome of the virus is a single-stranded negative RNAs consisting of 8 segments that encode 10 proteins. Hemagglutinin (HA), a surface glycoprotein encoded by the fourth segment, is the main protective antigen of influenza virus and can stimulate the production of specific neutralizing antibodies. Therefore, HA is the first antigen of genetic engineering vaccine, and it is also the main antigen of influenza virus detection. The study of hemagglutinin of influenza virus is helpful to the prevention and control of influenza and the further study of vaccine and diagnostic reagent. In this study, the full-length gene sequence of HAH GenBank: GQ122097.1) was used to optimize the codon by epitope analysis. The hydrophobic amino acid sequence is removed to optimize the gene sequence and synthesize the target gene. The target gene was ligated into the expression vector pET-30Xa / L IC. the target gene was transformed into E. coli BL21DDE3, digested and sequenced. The HA fusion protein was successfully expressed by IPTG induction and SDS-PAGE analysis. The optimal induction conditions were as follows: the final concentration of IPTG was 0.05 mmol / L at 37 鈩

本文編號：1987239