發(fā)布時(shí)間：2018-06-02 23:53

  本文選題：HIV病毒 + DNA疫苗��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年碩士論文

【摘要】：艾滋病是對人類健康的巨大威脅,已成為嚴(yán)重的社會公共衛(wèi)生問題。大力開展艾滋病的防治是全世界面臨的緊迫任務(wù)。經(jīng)過20多年艱苦卓絕的研究工作,抗HIV藥物已取得了很大進(jìn)展,艾滋病疫苗研究雖未取得預(yù)期的成功,但近年來也取得了一些令人鼓舞的進(jìn)展。如2009年在泰國進(jìn)行的大規(guī)模艾滋病疫苗試驗(yàn)表明:與未接種疫苗者相比,接種艾滋病疫苗人群HIV-1的感染風(fēng)險(xiǎn)減少超過31%。這表明有效的HIV疫苗仍然可以成為控制HIV流行的有效手段。DNA疫苗可有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫、體液免疫及黏膜免疫應(yīng)答,是HIV疫苗發(fā)展的重要策略之一。采用DNA疫苗初免并結(jié)合其它形式的疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫的免疫策略(Priming-Boost策略)是HIV疫苗發(fā)展的最主要的策略之一。但是DNA疫苗目前仍存在免疫原性較低、免疫劑量較大等問題。為了有效增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性,本研究以人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻作為疫苗遞送載體,以HIV-1 Env gp140作為模式免疫原,構(gòu)建以菌蛻為基礎(chǔ)的新型HIV核酸疫苗,并采用Priming-Boost策略用重組蛋白疫苗或重組活病毒載體疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫,開展了以人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻為基礎(chǔ)的新型HIV核酸疫苗研究。 1、人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻的制備及其生物學(xué)特征分析 (1)人傷寒沙門菌Ty21a的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化:本研究采用電擊轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)噬菌體E蛋白的裂解質(zhì)粒pMBE轉(zhuǎn)化入人傷寒沙門菌Ty21a,通過不同的電擊電壓的選擇,最終確定最佳轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果顯示,電壓1 KV時(shí),細(xì)胞大量死亡;電壓250V和500 V時(shí),均能實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,然而后者轉(zhuǎn)化效率稍高于前者,二者無顯著差異。電壓500 V、電阻200Ω、電容25μF是Ty21a菌的最佳電擊轉(zhuǎn)化條件。 (2)人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻的制備:重組Ty21a菌(pMBE)在28℃培養(yǎng)至對數(shù)生長中期,將培養(yǎng)物分為兩份。一份溫度迅速升至42℃誘導(dǎo)細(xì)菌裂解,另一份于28℃繼續(xù)培養(yǎng)作為對照。結(jié)果顯示,42℃誘導(dǎo)后1h,Ty21a菌已開始裂解,在4h時(shí)裂解最充分。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果可得重組Ty21a菌(pMBE)裂解前的菌液CFU為90×10~5,而裂解后的菌液CFU為3×10~5,裂解效率達(dá)96.77%。 (3)人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻的鑒定:采用電鏡觀察和細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)對Ty21a菌蛻進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征和存活率分析。結(jié)果表明,Ty21a菌在誘導(dǎo)后形成菌蛻,呈空泡狀結(jié)構(gòu),并能看到溶菌孔道,直徑介于200~400 nm之間。菌蛻保留了完整的細(xì)菌外膜,但因?yàn)榘麅?nèi)物質(zhì)被釋放出去,細(xì)菌發(fā)生明顯皺縮。Ty21a菌在經(jīng)過E裂解蛋白的誘導(dǎo)裂解以及隨后的凍干處理后,Ty21a菌全部失活。 (4)人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻的裝載效率分析:以綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1進(jìn)行Ty21a菌蛻裝載條件的優(yōu)化,并在此基礎(chǔ)上利用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,裝載溫度和裝載時(shí)間的不同對菌蛻裝載效率無顯著影響,而菌蛻裝載DNA效率與質(zhì)粒濃度呈正相關(guān);平均每個(gè)菌蛻裝載103~104拷貝質(zhì)粒,具有較高的裝載效率。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,Ty21a菌蛻可被巨噬細(xì)胞RAW264.7有效吞噬,從而有效攝取質(zhì)粒pEGFP-N1,并在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)。表明了Ty21a菌蛻作為一種新型的DNA疫苗遞送載體,不但裝載效率高,還可有效靶向質(zhì)粒DNA到抗原遞呈細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)目的抗原的表達(dá)。 2、Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗不同免疫方式及免疫效果研究 (1) Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗的制備:按照優(yōu)化的Ty21a菌蛻裝載條件,進(jìn)行HIV DNA疫苗pSV140質(zhì)粒的裝載,制備了Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗(以下簡稱“Ty21aBG(DNA)疫苗”),并進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ty21a菌蛻可有效介導(dǎo)HIV DNA疫苗遞呈到巨噬細(xì)胞RAW264.7,并實(shí)現(xiàn)目的抗原的有效表達(dá)。 (2) Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗皮下途徑誘導(dǎo)小鼠免疫效果分析:Ty21aBG(DNA)疫苗皮下途徑免疫BALB/c小鼠,并于末次免疫后第10天進(jìn)行血清gp120特異性IgG抗體、小腸灌洗液sIgA抗體和胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞檢測。血清gp120特異性IgG抗體檢測結(jié)果表明,與裸DNA疫苗相比,Ty21aBG(DNA)疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)IgG抗體,并且IgG1抗體水平高于IgG2a,提示Ty21aBG(DNA)疫苗誘導(dǎo)了Th1/Th2平衡的免疫應(yīng)答,初步說明Ty21a菌蛻可有效彌補(bǔ)DNA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫水平低的不足。小腸灌洗液sIgA抗體檢測結(jié)果表明,Ty21aBG(DNA)疫苗可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答。胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明,Ty21aBG(DNA)疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。 為了進(jìn)一步分析Ty21aBG(DNA)疫苗增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答水平的原因,以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7作為體外模型,以BALB/c小鼠作為體內(nèi)模型,進(jìn)行了免疫機(jī)制研究。結(jié)果表明,與裸DNA疫苗組相比,無論RAW264.7細(xì)胞或BALB/c小鼠,在接種Ty21aBG(DNA)的早期,血清IFN-γ和IL-12細(xì)胞因子的分泌水平無顯著增強(qiáng),而IL-10細(xì)胞因子分泌水平顯著升高(P0.01)。表明Ty21aBG(DNA)疫苗能顯著增強(qiáng)機(jī)體Th2型免疫應(yīng)答,從而增強(qiáng)了DNA疫苗所誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答能力,實(shí)現(xiàn)了體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的平衡。 (3) Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗肌肉途徑誘導(dǎo)小鼠免疫效果分析:Ty21aBG(DNA)疫苗肌肉途徑免疫BALB/c小鼠,并于末次免疫后第10天進(jìn)行血清gp120特異性總IgG抗體和亞類檢測。結(jié)果表明,與裸DNA疫苗相比,Ty21aBG(DNA)疫苗肌肉途徑免疫BALB/c小鼠,可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。IgG抗體的亞類分析結(jié)果說明,Ty21aBG(DNA)疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體Th1/Th2平衡的免疫應(yīng)答;并且IgG1抗體水平高于IgG2a抗體,提示了Ty21aBG(DNA)疫苗能增強(qiáng)Th2型免疫應(yīng)答。 (4) Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗局部黏膜途徑誘導(dǎo)小鼠免疫效果分析:為了分析Ty21aBG(DNA)疫苗能否通過局部黏膜途徑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,本研究選擇了兩種常規(guī)黏膜途徑—灌胃免疫和滴鼻免疫途徑,進(jìn)行此疫苗誘導(dǎo)BALB/c小鼠免疫效果分析,并于末次免疫后第10天進(jìn)行血清gp120特異性總IgG抗體和亞類檢測。結(jié)果表明,與裸DNA疫苗相比,Ty21aBG(DNA)疫苗黏膜途徑免疫BALB/c小鼠,可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的IgG抗體(P0.05),說明了Ty21aBG(DNA)疫苗經(jīng)黏膜免疫可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。 3、Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗與其他形式HIV疫苗聯(lián)合免疫實(shí)驗(yàn)研究 (1) Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗與重組蛋白疫苗聯(lián)合免疫的免疫效果分析: Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗皮下途徑進(jìn)行初次免疫,Ty21a菌蛻型gp120蛋白疫苗(以下簡稱“Ty21aBG (gp120)蛋白疫苗”)肌肉途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫,開展了此疫苗誘導(dǎo)小鼠的免疫效果分析。結(jié)果表明,Ty21aBG (gp120)蛋白疫苗加免,無需佐劑,便可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。進(jìn)一步分析,此疫苗策略可同時(shí)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生gp120/Thai B和gp120/CRF01_AE兩種抗原特異性的血清IgG抗體,與單純Ty21aBG(DNA)疫苗策略相比,gp120/Thai B特異性IgG抗體效價(jià)無顯著差異,而gp120/CRF01_AE特異性IgG抗體效價(jià)則有顯著升高,揭示了Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗與重組蛋白疫苗聯(lián)合免疫策略可顯著增強(qiáng)DNA疫苗所誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答能力。 (2)Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗與重組活病毒疫苗聯(lián)合免疫的免疫效果分析:Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗皮下途徑進(jìn)行初次免疫,重組MVTT活病毒疫苗肌肉途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫,開展了此疫苗誘導(dǎo)小鼠的免疫效果分析。結(jié)果表明,重組MVTT活病毒疫苗加強(qiáng)免疫,可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答;誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的血清IgG類型以IgG2a為主,說明Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗與重組活病毒疫苗聯(lián)合免疫策略可誘導(dǎo)Th1/Th2免疫應(yīng)答,并且能增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答,從而有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答,實(shí)現(xiàn)了體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的平衡。 4、結(jié)論 利用噬菌體PhiX174 E裂解蛋白成功制備具有完整胞膜結(jié)構(gòu)的人傷寒沙門菌Ty21a菌蛻;Ty21a菌蛻作為一種新型DNA疫苗遞送載體,能有效靶向DNA疫苗到抗原遞呈細(xì)胞,并實(shí)現(xiàn)目的抗原的有效表達(dá)。Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗經(jīng)皮下途徑和肌肉途徑免疫小鼠,無需佐劑,可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗不但能通過系統(tǒng)免疫途徑,還能通過局部黏膜免疫途徑(滴鼻途徑和灌胃途徑)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗與其他形式HIV疫苗如重組蛋白疫苗或重組活病毒疫苗進(jìn)行聯(lián)合免疫,可顯著增強(qiáng)小鼠特異性免疫應(yīng)答水平。因此,Ty21a菌蛻型HIV DNA疫苗是一種非常有前景的HIV候選疫苗。
[Abstract]:HIV - 1 is one of the most important strategies for the development of HIV vaccine . HIV - 1 Env gp140 is used as a vaccine delivery vehicle , HIV - 1 Env gp140 is used as a vaccine delivery vehicle , and HIV - 1 Env gp140 is used as a model immunogen to build a novel HIV vaccine .

Preparation and biological characteristics of Ty21a bacteria isolated from Salmonella typhi

( 1 ) The transformation condition of Salmonella typhi Ty21a was optimized . The transformation method was used to transform the lytic plasmid pMBE expressing the phage E protein into human typhoid Salmonella Ty21a . The optimal transformation conditions were determined by the selection of different electric shock voltages . The results showed that the transformation efficiency of the cells was slightly higher than that of the former , but the transformation efficiency was slightly higher than that of the former , but the transformation efficiency was slightly higher than that of the former .

( 2 ) Preparation of Salmonella typhi Ty21a : The recombinant Ty21a strain ( pMBE ) was cultured at 28.degree . C . for medium term . The culture was divided into two . One temperature was rapidly raised to 42 鈩，

本文編號：1970663