本文選題：C-X-C型趨化因子受體4 + 間充質(zhì)干細(xì)胞　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：目的：構(gòu)建小鼠C-X-C型趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor type4,Cxcr4）基因的慢病毒表達(dá)載體，體外驗(yàn)證其對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSCs）的生物學(xué)特性的影響，探討過表達(dá)CXCR4對MSCs歸巢影響，以及對小鼠造血和免疫恢復(fù)及對GVHD防治作用。 方法：（1）克隆小鼠Cxcr4基因，構(gòu)建攜帶Cxcr4基因與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）雙順反子結(jié)構(gòu)的重組慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒LV-CXCR4-IRES-EGFP。脂質(zhì)體法包裝病毒，并測定滴度。（2）優(yōu)化慢病毒感染MSCs條件，建立高表達(dá)CXCR4或EGFP細(xì)胞（分別定義為CXCR4-MSC和EGFP-MSC），繪制生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測體外遷移能力，Cell counting kit-8（CCK-8）法檢測MSCs對小鼠原代淋巴細(xì)胞增殖影響。（3）受鼠接受全身照射（total body irradiation, TBI）24小時后尾靜脈注射5×10~5個CXCR4-MSC或EGFP-MSC，冰凍切片觀察MSCs在受鼠體內(nèi)分布，流式細(xì)胞術(shù)檢測歸巢效率，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA）檢測外周血和骨髓中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromalcell derived factor-1, SDF-1）水平。（4）建立小鼠同基因移植模型。照射24小時后輸注5×10~5個CXCR4-MSC或EGFP-MSC，移植后外周血計數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)測定骨髓中造血干細(xì)胞比例，組織病理學(xué)檢測脾臟和骨髓。（5）以C57BL/6小鼠為供鼠， BALB/c小鼠為受鼠，建立異基因骨髓移植模型。受鼠接受TBI（條件同前）后隨機(jī)分為5組：allo-BMT組（輸注5×10~6個供鼠骨髓細(xì)胞（bone marrowcell, BMC）、GVHD組（allo-BMT組基礎(chǔ)上+2×10~6個脾細(xì)胞（splenocyte, SP）、CXCR4-MSC組（GVHD組基礎(chǔ)上+5×10~5個CXCR4-MSC）、EGFP-MSC組（GVHD組基礎(chǔ)上+5×10~5個EGFP-MSC）和TBI組（輸注等體積PBS）。移植后觀察生存率，進(jìn)行GVHD臨床和病理評分；外周血細(xì)胞計數(shù)；流式細(xì)胞術(shù)分析免疫細(xì)胞恢復(fù)情況；流式微珠陣列法（Cytometric BeadArray, CBA）檢測外周血中細(xì)胞因子水平。 結(jié)果：（1）成功克隆小鼠Cxcr4基因，正確構(gòu)建重組慢病毒載體LV-CXCR4-IRES-EGFP和對照載體LV-IRES-EGFP。成功制備共表達(dá)CXCR4和報告基因EGFP的慢病毒顆粒，濃縮后病毒滴度達(dá)1.8×10~8TU/mL。（2）優(yōu)化條件后，慢病毒顆粒對小鼠MSCs感染效率可達(dá)70%。LV-CXCR4-IRES-EGFP感染組CXCR4的表達(dá)明顯高于對照組。劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)CXCR4可明顯提高M(jìn)SCs向高濃度SDF-1的遷移能力。高表達(dá)CXCR4后對MSCs增殖與凋亡無明顯影響，亦不影響MSCs對淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。（3）冰凍切片與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示過表達(dá)CXCR4可明顯提高M(jìn)SCs歸巢效率，ELISA結(jié)果顯示照射24小時后小鼠外周血及骨髓中SDF-1水平明顯升高。（4）在同基因骨髓移植后，輸注MSCs不影響受鼠生存率，受鼠狀態(tài)良好。輸注CXCR4-MSC可促進(jìn)外周血白細(xì)胞、血小板和造血器官恢復(fù)，且效果優(yōu)于EGFP-MSC組，同時可促進(jìn)骨髓中造血干細(xì)胞恢復(fù)。（5）異基因骨髓移植后聯(lián)合輸注MSCs可提高受鼠生存率，并且可促進(jìn)受鼠精神、飲食、體重和活動等一般狀況恢復(fù)。聯(lián)合移植MSCs可降低GVHD臨床和病理評分。輸注CXCR4-MSC受鼠外周血細(xì)胞恢復(fù)較快，，與GVHD組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。同時，CXCR4-MSC組可加速外周血中免疫細(xì)胞恢復(fù)，并且輸注CXCR4-MSC可調(diào)節(jié)異基因骨髓移植后細(xì)胞因子平衡，降低外周血中IL-2, IL-6,IFN-γ和TNF-α水平，增加IL-4和IL-10水平。 結(jié)論：成功構(gòu)建重組慢病毒載體LV-CXCR4-IRES-EGFP，慢病毒載體系統(tǒng)可高效介導(dǎo)外源性Cxcr4基因在小鼠MSCs表達(dá)，經(jīng)體外驗(yàn)證其具有生物學(xué)活性。過表達(dá)Cxcr4基因可促進(jìn)MSCs歸巢，加速小鼠同基因和異基因骨髓移植后造血和免疫恢復(fù)，并可減輕異基因骨髓移植后GVHD。
[Abstract]:Objective : To construct a slow virus expression vector of C - X - C chemokine receptor type4 ( Cxcr4 ) gene in mice . The effects of CXCR4 on the biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) were studied in vitro . The effects of CXCR4 on the homing of MSCs were discussed .

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本文編號：1970394