本文選題：早孕因子 + 原核表達(dá)��； 參考：《鄭州大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：早孕因子(early pregnancy factor, EPF)是哺乳動(dòng)物妊娠早期母體血清中最早出現(xiàn)的一種免疫抑制因子。具有免疫抑制和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)兩種功能,為目前最早確認(rèn)妊娠的生化指標(biāo)之一。小鼠受精后6h,豬、牛、山羊24 h,人受精48 h即可從母體內(nèi)測(cè)出EPF,這些遠(yuǎn)早于人絨毛膜促性腺激素(hCG)測(cè)定,而且EPF的活性可以在妊娠期存在很長(zhǎng)時(shí)間,因此對(duì)EPF的活性檢測(cè)可用于牛、馬的早期妊娠診斷。EPF在孕婦的超早孕診斷中準(zhǔn)確率達(dá)88.6%,因此,EPF在早孕診斷方面的應(yīng)用,將對(duì)人類及畜牧業(yè)有重要的意義。 為獲得人早孕因子重組蛋白,提取人肝癌SMMC-7721細(xì)胞總RNA,對(duì)早孕因子基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、TA克隆和測(cè)序,通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增人早孕因子基因,克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6p-1和pET-28a,分別與GST基因和his基因相融合,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),以SDS-PAGE和Western blot分析重組蛋白的表達(dá),通過(guò)GST樹(shù)脂和純化表達(dá)蛋白。結(jié)果成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX6p-EPF,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了GST-EPF融合蛋白,表達(dá)蛋白分子量為37.3 kDa,并能被抗GST單克隆抗體特異識(shí)別,通過(guò)GST親和層析純化,制備得到EPF重組蛋白,pET28-EPF重組質(zhì)粒成功構(gòu)建,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了his-EPF融合蛋白,表達(dá)蛋白分子量為17kDa,并能被抗his單抗特異識(shí)別,通過(guò)鎳柱純化得蛋白。玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)證明了蛋白活性。 為研究EPF的生長(zhǎng)因子作用,建立EPF對(duì)細(xì)胞有明顯促生長(zhǎng)作用的細(xì)胞模型,將不同濃度梯度的EPF分別加入Marc145、NSO、PK15、BHK及人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中,通過(guò)顯微鏡觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)判斷EPF對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響,發(fā)現(xiàn)在Marc145和NSO細(xì)胞系中細(xì)胞數(shù)目有明顯增多,初步篩選出Marc145和NSO兩種細(xì)胞系作為促生長(zhǎng)細(xì)胞模型。
[Abstract]:Early pregnancy factor, EPF) is one of the earliest immunosuppressive factors in mammalian maternal serum. It has two functions of immunosuppression and growth regulation, which is one of the earliest biochemical indexes to confirm pregnancy. EPFs were detected from the mother at 6 h after fertilization in mice, 24 hours in pigs, cattle and goats, and 48 hours in human fertilization. These results were far earlier than those of human chorionic gonadotropin (hCGG), and the activity of EPF could exist for a long time during pregnancy. Therefore, the detection of EPF activity can be used in the diagnosis of bovine and horse early pregnancy. The accuracy of EPF in the diagnosis of super early pregnancy of pregnant women is 88.6. therefore, the application of EPF in the diagnosis of early pregnancy will be of great significance to human beings and animal husbandry. In order to obtain the recombinant protein of human early pregnancy factor and extract the total RNAs of human hepatoma SMMC-7721 cells, the gene of early pregnancy factor was cloned and sequenced by RT-PCR amplification, and the gene of human early pregnancy factor was amplified by PCR. The plasmid was cloned into prokaryotic expression vector pGEX-6p-1 and pET-28a and fused with GST gene and his gene respectively. The recombinant expression plasmid was constructed and transformed into Escherichia coli expression strain BL21. The expression was induced by isopropyl- 尾 -D- thiogalactoside (IPTG). The expression of the recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE and Western blot, and the expressed protein was purified by GST resin. Results the recombinant expression plasmid pGEX6p-EPFwas successfully constructed, and the GST-EPF fusion protein was induced and expressed in Escherichia coli. The molecular weight of the expressed protein was 37.3 kDa. it could be specifically recognized by monoclonal antibody against GST and purified by GST affinity chromatography. The recombinant plasmid of EPF recombinant protein pET28-EPF was successfully constructed, and his-EPF fusion protein was induced and expressed in Escherichia coli. The molecular weight of the expressed protein was 17kDa. the protein could be specifically recognized by anti his monoclonal antibody. The protein was purified by nickel column. The activity of protein was proved by rosette inhibition experiment. In order to study the effect of EPF on the growth factor and to establish a cell model with obvious growth promoting effect of EPF, EPF with different concentration gradient was added to the cells of Marc145 NSOP PK15 BHK and SMMC-7721 cells of human hepatocellular carcinoma respectively. The effect of EPF on cell number was determined by microscopic observation and cell count. It was found that the number of cells in Marc145 and NSO cell lines increased obviously. Two cell lines, Marc145 and NSO, were preliminarily selected as growth promoting cell models.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R-332

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本文編號(hào)：1965565