本文選題：CaMKⅡα + Cre重組酶��； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：Cre/LoxP系統(tǒng)介導(dǎo)的條件性基因敲除技術(shù)(conditional gene knockout)是目前基因功能研究中最重要的技術(shù)之一,它克服了傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)存在的諸多弊端。在神經(jīng)系統(tǒng)研究方面,該技術(shù)的運(yùn)用可使基因敲除僅發(fā)生在大腦的某個(gè)亞區(qū)或發(fā)育過(guò)程的某個(gè)階段,從而有利于對(duì)大腦基因功能進(jìn)行精細(xì)研究。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)條件性基因敲除而言,組織特異性啟動(dòng)子的選擇至關(guān)重要。研究表明,CaMKⅡα基因的表達(dá)具有較強(qiáng)時(shí)空特異性,符合制備前腦神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠的要求。 神經(jīng)細(xì)胞特異性Cre表達(dá)載體(PCCEⅠ)已在前期研究工作中構(gòu)建成功。本項(xiàng)研究是利用線性化的PCCEⅠ載體通過(guò)原核顯微注射的方法制備CaMKⅡα- Cre轉(zhuǎn)基因小鼠,并對(duì)小鼠體內(nèi)各組織中Cre基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),從而建立前腦神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠,為進(jìn)一步制備條件性ADAM10基因敲除小鼠奠定基礎(chǔ),有助于對(duì)阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。 通過(guò)原核顯微注射的方法將12.318 kb的轉(zhuǎn)基因片段CaMKⅡα-Cre引入小鼠受精卵,獲得子代小鼠81只,經(jīng)PCR檢測(cè),有7只小鼠在基因組上整合有CaMKⅡα- Cre基因(編號(hào)分別為PCCE5、PCCE10、PCCE19、PCCE59、PCCE60、PCCE65和PCCE75),整合率為8.6%。將7只小鼠分別與野生型C57BL/6J小鼠雜交,通過(guò)PCR法篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠。利用RT-PCR方法檢測(cè)證實(shí),Cre重組酶基因在PCCE10、PCCE19和PCCE60三個(gè)品系轉(zhuǎn)基因小鼠的前腦皮層和海馬中有轉(zhuǎn)錄活性,而在其它組織中無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。將CaMKⅡα- Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與ADAM10~LoxP/LoxP轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,利用PCR法證實(shí)在子代雙重轉(zhuǎn)基因小鼠中,Cre重組酶僅在前腦皮層和海馬中介導(dǎo)LoxP位點(diǎn)間的基因重組。再將CaMKⅡα- Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與ROSA26-LacZ報(bào)告基因小鼠雜交,檢測(cè)LacZ基因在子代雙重轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)的組織分布,結(jié)果表明,出生后第1天(P1),LacZ基因僅在前腦和海馬的神經(jīng)細(xì)胞中散在表達(dá);出生后4周,LacZ基因在大腦(尤其是前腦和海馬)中有明顯表達(dá),而在其它組織中無(wú)表達(dá);而在胚胎期第16天(E16),LacZ基因在整個(gè)大腦中均無(wú)表達(dá),從而證實(shí)了Cre重組酶在小鼠出生后發(fā)揮了重組的功能。最后,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)三個(gè)品系的CaMKⅡα-Cre轉(zhuǎn)基因首建鼠的外源基因拷貝數(shù),結(jié)果表明PCCE10、PCCE19和PCCE60的外源基因插入拷貝數(shù)分別為19、7和5。并且,用遺傳育種的方法證實(shí)了篩選出的子代純合子轉(zhuǎn)基因小鼠。 綜上所述,本研究制備的CaMKⅡα-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠在前腦中特異性表達(dá)Cre重組酶并能成功地介導(dǎo)LoxP位點(diǎn)間的基因重組,建立起的純合子轉(zhuǎn)基因小鼠品系為神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的基因功能研究提供了寶貴的工具小鼠。
[Abstract]:Conditional gene knockout (conditional gene knockout) mediated by Cre/LoxP system is one of the most important techniques in gene function research. It overcomes many disadvantages of traditional gene knockout technology. In the research of nervous system, the use of this technique can make gene knockout occur only in a subregion of the brain or at a certain stage of the development process, which is beneficial to the detailed study of the gene function of the brain. The selection of tissue specific promoters is very important for nervous system conditional gene knockout. The results showed that the expression of CaMK 鈪，

本文編號(hào)：1942352