本文選題：ClpX + 熱休克蛋白��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：目的 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae, S. pn）定植于人類上呼吸道粘膜表面，能引起肺炎、腦膜炎、敗血癥等一系列疾病，在全球范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率和病死率。隨著抗生素耐藥形勢的日趨嚴峻，疫苗在預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病中的作用愈發(fā)重要。 肺炎鏈球菌ClpX屬于HSP100/Clp（酪蛋白水解酶）家族，作為ATP酶亞單位與蛋白酶亞單位ClpP組成ClpXP復(fù)合物，有分子伴侶功能，在熱應(yīng)激耐受、底物識別等過程中發(fā)揮著重要的作用，與肺炎鏈球菌的生存、毒力密切相關(guān)，同時生物信息學提示該蛋白可能表達于細菌胞外，提示ClpX可能是一個較好的疫苗候選蛋白。因此，本研究旨在探討ClpX粘膜免疫對肺炎鏈球菌的保護效果及其機制，評估其作為疫苗候選蛋白的可行性。 方法 利用原核表達技術(shù)從大腸埃希菌中表達出S. pn ClpX蛋白（全長），純化后免疫BALB/c小鼠制備特異性多克隆抗血清。生物信息學預(yù)測S. pn中ClpX在細胞內(nèi)外的表達情況，并利用所制備的anti-ClpX多克隆抗血清，經(jīng)流式細胞術(shù)及Western blot對其進行亞細胞定位分析驗證；PCR及Western blot分析ClpX在9種不同血清型肺炎鏈球菌中的保守性；ELISA測定肺炎鏈球菌感染患兒、健康兒童以及健康成人血清中ClpX特異性IgG效價；以霍亂毒素(Cholera Toxin, CT)為佐劑，純化重組ClpX（rClpX）蛋白經(jīng)鼻腔粘膜免疫BALB/c小鼠，ELISA測定免疫后小鼠血清及唾液中特異性抗體效價及亞型，以及脾細胞經(jīng)刺激后細胞因子的分泌水平。以S. pn CMCC31693（19F型）進行鼻腔攻毒，于攻毒第5天取小鼠鼻腔灌洗液，計數(shù)細菌載量；以S. pn D39（2型）及CMCC31614（14型）分別進行鼻腔攻毒，監(jiān)測小鼠生存率。 結(jié)果 成功構(gòu)建pET-28(a)-clpX重組質(zhì)粒，經(jīng)表達純化后獲得純度＞90%的重組ClpX蛋白；生物信息學分析預(yù)測ClpX可能為分泌型蛋白，，流式細胞術(shù)結(jié)果表明ClpX不表達于S. pn表面；分離細菌亞組分進行Western blot分析，ClpX在S. pn培養(yǎng)上清中檢測出來，提示其為分泌型表達；PCR及Western blot結(jié)果顯示，9種不同血清型S. pn中ClpX均保守存在；健康兒童血清中ClpX特異性抗體水平高于同年齡組S. pn患兒，且該抗體水平呈現(xiàn)年齡依賴性增長；與對照組相比，純化rClpX蛋白粘膜免疫小鼠能有效刺激機體血清及唾液中產(chǎn)生高滴度的IgG及IgA水平（P＜0.01），且血清中的IgG以IgG1及IgG2b為主；另外，粘膜免疫rClpX還能有效刺激機體脾細胞產(chǎn)生高水平的IL-17A和IL-4（P＜0.05）；不同血清型S. pn粘膜攻毒結(jié)果顯示，粘膜免疫rClpX能顯著降低19F型S. pn在鼻咽部的定植（P＜0.001），提高2型（P＜0.05）和14型（P＜0.01）S. pn攻毒后小鼠的生存率。 結(jié)論 肺炎鏈球菌ClpX蛋白為分泌型蛋白，在不同血清型S. pn菌株保守性好，在人體中具有免疫原性，滿足S. pn疫苗候選蛋白的基本要求。粘膜免疫rClpX能有效刺激機體產(chǎn)生Th2及Th17介導為主的免疫反應(yīng)，對不同血清型S. pn的鼻咽部定植以及致死性感染有較好的保護效果。因此，ClpX蛋白是一種較好的肺炎鏈球菌疫苗候選蛋白。
[Abstract]:Purpose

Streptococcus pneumoniae ( S.pn ) is implanted on the surface of human upper respiratory tract , can cause a series of diseases such as pneumonia , meningitis and septicemia , and has high morbidity and mortality worldwide .

Streptococcus pneumoniae ClpX belongs to the family of HSP100 / Clp ( casein hydrolase ) , which is a ClpXP complex composed of the subunit of ATP enzyme and ClpP of protease subunit . It plays an important role in the process of heat stress tolerance , substrate recognition and so on . It is suggested that ClpX may be a better candidate protein in heat stress tolerance and substrate recognition . Therefore , this study aims to investigate the protective effect and mechanism of ClpX mucosal immunity against Streptococcus pneumoniae , and evaluate its feasibility as vaccine candidate protein .

method

S . pn ClpX protein ( full - length ) was expressed from Escherichia coli by prokaryotic expression technique . The specific polyclonal antiserum was prepared by immunizing BALB / c mice after purification . Bioinformatic prediction was used to predict the expression of ClpX in S . pn .
The conservative properties of ClpX in 9 different serotypes of Streptococcus pneumoniae were analyzed by PCR and Western blot ;
Determination of ClpX - specific IgG titer in children with Streptococcus pneumoniae infection , healthy children and healthy adult serum by ELISA ;
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本文編號：1940093