本文選題：褪黑素 + 白介素-1β　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年博士論文

【摘要】：目的： 第二部分：為了探討褪黑素(MEL)對血管單層內(nèi)皮細(xì)胞屏障的保護(hù)作用,以培養(yǎng)在Transwell系統(tǒng)內(nèi)的單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為模型,觀察MEL對IL-1β誘導(dǎo)的單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。 第二部分：觀察MEL對IL-1β誘導(dǎo)的HUVECs間黏附連接和細(xì)胞骨架的影響。 第三部分：探討MEL對單層內(nèi)皮細(xì)胞屏障保護(hù)作用可能的受體途徑和信號(hào)通路。 方法： 第一部分：原代分離培養(yǎng)HUVECs,并使用包被小鼠抗人CD31單克隆抗體的免疫磁珠對原代分離的HUVECs進(jìn)一步純化。以小鼠抗人vWF單克隆抗體及FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗鑒定純化后的HUVECs。將純化后的HUVECs接種在Transwell系統(tǒng),通過檢測不同干預(yù)條件下透過單層內(nèi)皮的熒光標(biāo)記的葡聚糖來反映內(nèi)皮通透性的改變。 第二部分：用免疫熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察不同干預(yù)條件下內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接蛋白VE鈣粘素(VE-cadherin)和細(xì)胞骨架蛋白的變化情況。使用Western blot檢測VE-cadherin的表達(dá)變化情況。 第三部分：檢測MEL和IL-1p對影響內(nèi)皮細(xì)胞間連接和細(xì)胞骨架的重要的信號(hào)通路Rho GTPase家族中Rac蛋白的影響；應(yīng)用MEL受體阻滯劑Luz、Rac的抑制劑NSC-23766,探討MEL發(fā)揮HUVECs屏障保護(hù)作用的受體途徑和信號(hào)通路。 結(jié)果： 第二部分：(1)成功分離培養(yǎng)原代HUVECs,免疫磁珠篩選后能繼續(xù)貼壁生長并傳代,倒置顯微鏡下HUVECs呈鵝卵石狀,vWF免疫熒光染色證實(shí)細(xì)胞確為HUVECs。細(xì)胞呈梭形、圓形或多角形。(2)與空白對照組相比,5、10和20ng/mL的IL-1β分別使HUVECs通透性由1.5±0.1升高為4.8±0.3、5.2±0.4和9.8±0.8(P0.01)；10和100μmol/L的MEL分別使10ng/mL的IL-1β誘導(dǎo)的通透性從5.2±0.4降至2.8±0.3和2.7±0.3(P0.01)。此結(jié)果與“時(shí)間-過程”通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 第三部分：(1)熒光顯微鏡觀察：正常融合后的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VE-cadherin呈現(xiàn)出連續(xù)不間斷的狀態(tài)；IL-1β(10ng/ml)破壞了細(xì)胞間的黏附連接,使VE-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)下調(diào),并出現(xiàn)斷裂。MEL(10μmol/L)預(yù)處理后,VE-cadherin的表達(dá)狀態(tài)得到了改善。(2)激光共聚焦顯微鏡下觀察：IL-1β(10ng/ml)明顯的破壞了細(xì)胞間的黏附連接,使正常狀態(tài)下分布在細(xì)胞邊緣的肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭缂?xì)胞體的應(yīng)力纖維,原本融合的細(xì)胞間出現(xiàn)明顯的縫隙。MEL(10μmol/L)預(yù)處理后,沒有出現(xiàn)明顯的黏附連破壞現(xiàn)象,細(xì)胞中心應(yīng)力纖維的表達(dá)減少,邊緣部位的肌動(dòng)蛋白增加,細(xì)胞間縫隙變小。(3)Western Blot結(jié)果表明：與對照組相比,IL-1p使HUVECs的VE-cadherin表達(dá)量下調(diào)。MEL可抑制IL-18誘導(dǎo)的VE-cadherin下調(diào),但仍低于對照組。 第三部分：(1)Luz阻斷了MEL對內(nèi)皮屏障的保護(hù)作用；阻斷了MEL對內(nèi)皮黏附連接和細(xì)胞骨架的影響,導(dǎo)致細(xì)胞連接破壞和應(yīng)力纖維增加,細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙。(2)MEL預(yù)處理抑制了IL-1β誘導(dǎo)的Rac的失活,而Luz可以阻斷MEL的這種作用。(3)NSC-23766抑制了MEL對內(nèi)皮屏障的保護(hù)作用。 結(jié)論：(1)IL-1β誘導(dǎo)HUVECs黏附連接蛋白VE-cadherin表達(dá)降低,應(yīng)力纖維增加,細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙,通透性升高。(2)MEL通過激活Rac信號(hào)途徑改善了內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接和細(xì)胞骨架的狀態(tài),抑制了IL-1β誘導(dǎo)的內(nèi)皮通透性的升高。
[Abstract]:Purpose :


The second part : To investigate the protective effect of melatonin ( MEL ) on vascular endothelial cell barrier , the effect of MEL on the permeability of single - layer endothelial cells induced by IL - 1尾 was observed in vitro .


The second part : To observe the effect of MEL on IL - 1尾 - induced intercellular adhesion and cellular skeleton .


The third part : To investigate the possible receptor pathway and signal pathway of MEL on the protective effect of single - layer endothelial cells .


Method :


In the first part , the primary isolated culture was isolated and further purified by immunomagnetic beads coated with mouse anti - human CD31 monoclonal antibody . The mouse anti - human monoclonal antibody and FITC - labeled goat anti - mouse fluorescent antibody were used for the identification and purification . After purification , the purified culture was inoculated in the Transwell system , and the changes of endothelial permeability were reflected by detecting the fluorescent labeled glucan of the single - layer endothelium under different intervention conditions .


In the second part , we observed the changes of E - cadherin and E - cadherin in endothelial cells under different intervention conditions by immunofluorescence microscopy and laser confocal microscope . The expression of VE - cadherin was detected by Western blot .


The third part : The effects of MEL and IL - 1p on the expression of Rac protein in the family of signaling pathways , such as endothelial cell and cell skeleton , were examined .
The receptor pathway and signal pathway of the protective effects of MEL were investigated by using the inhibitor NSC - 23766 of the MEL receptor blocker , Luz , Rac .


Results :


The second part : ( 1 ) The cells were isolated and cultured in primary culture . After the screening of immune magnetic beads , the adherent growth was continued and the cells were passaged . The cells were fusiform , round or polygonal , and IL - 1尾 in 5 , 10 and 20 ng / mL increased from 1.5 鹵 0.1 to 4.8 鹵 0.3 , 5.2 鹵 0.4 and 9.8 鹵 0.8 respectively ( P0.01 ) .
In MEL of 10 and 100 渭mol / L , the permeability of IL - 1尾 induced by 10 ng / mL decreased from 5.2 鹵 0.4 to 2.8 鹵 0.3 and 2.7 鹵 0.3 respectively ( P0.01 ) .


The third part : ( 1 ) Fluorescence microscopy observation : The expression of VE - cadherin in endothelial cells after normal fusion showed a continuous uninterrupted state ;
After pretreatment with MEL ( 10 渭mol / L ) , the expression of E - cadherin was improved .


The third part : ( 1 ) Luz blocked the protective effect of MEL on endothelial barrier ;
( 2 ) MEL pretreatment inhibited the inactivation of IL - 1尾 - induced Rac and Luz blocked MEL ' s effect . ( 3 ) NSC - 23766 inhibited the protective effect of MEL on endothelial barrier .


Conclusion : ( 1 ) IL - 1尾 - induced expression of E - cadherin decreased , stress fiber increased , gap between cells increased , and permeability increased . ( 2 ) MEL improved the adhesion of endothelial cells and the state of cellular skeleton by activating Rac signaling pathway , and inhibited the increase of endothelial permeability induced by IL - 1尾 .
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1930376