本文選題：熱休克因子1 + 熱休克蛋白�。� 參考：《鄭州大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：背景 熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor1, Hsfl)是熱休克因子家族中的成員之一,熱休克家族成員包括Hsfl,Hsf2, Hsf3和Hsf4。這個家族成員具有保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,能夠識別并且與位于靶基因啟動子區(qū)域的熱休克元件(heatshockelement, HSE)結(jié)合。Hsfl是熱休克反應(yīng)的主要調(diào)控者,在熱休克或其他應(yīng)激條件下,失活的Hsfl高度磷酸化,Hsfl被激活并移位至細胞核,轉(zhuǎn)變成三聚體與HSE結(jié)合,可刺激熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)的轉(zhuǎn)錄。Hsfl介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)不僅保護細胞免受環(huán)境或細胞內(nèi)應(yīng)激引起的損傷,而且涉及到對許多病理過程的調(diào)節(jié),如炎癥和腫瘤的形成。眾多研究表明,在腫瘤形成和發(fā)展的調(diào)節(jié)過程中,Hsfl起了非常重要的作用,例如,Hsfl和其相關(guān)的下游靶蛋白(如HSPs)在大多數(shù)癌組織中是增高的。Hsfl敲除能夠抑制DMBA誘導(dǎo)的皮膚癌、p53突變誘導(dǎo)的淋巴瘤和DEN誘導(dǎo)的肝細胞癌,抑制HSP90分子伴侶的活性能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。這些證據(jù)表明,Hsfl和其調(diào)節(jié)的熱休克反應(yīng)能夠穩(wěn)定快速增殖的腫瘤細胞。 雖然,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hsfl與p53和Ras癌基因誘導(dǎo)的腫瘤形成有關(guān),而Hsfl在病毒性癌基因誘導(dǎo)形成腫瘤中的作用還不清楚。SV40是雙鏈的DNA腫瘤病毒,已經(jīng)從HIV陽性的非何杰金氏淋巴瘤病人組織中分離出來。SV40能夠表達兩種早期的癌蛋白小t抗原(t-antigen, t-ag)和大T抗原(T-antigen, T-ag), T-ag通常被用作轉(zhuǎn)基因腫瘤鼠模型和用于轉(zhuǎn)化細胞的體外研究。T-ag通過與p53和Rb相互作用和滅活腫瘤抑制因子p53和Rb的活性,能夠使很多種細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。 本課題中我們研究Hsf1在SV40T-ag轉(zhuǎn)化鼠胚胎成纖維細胞中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SV40T-ag轉(zhuǎn)化的WT/MEF細胞,MEF/Hsfl-/-細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl(重新構(gòu)建的Hsf1導(dǎo)入MEF/Hsfl-/-細胞)在裸鼠能夠形成成纖維細胞瘤,但是MEF/Hsfl-/-細胞和裸鼠腫瘤的生長明顯比WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞慢。結(jié)果表明,Hsfl參與了刺激SV40T-ag轉(zhuǎn)化細胞的增生。進一步研究表明,Hsfl缺失導(dǎo)致p53和Rb蛋白的蓄積,這可能與MEF/Hsfl-/-細胞生長的慢有關(guān)。我們的研究結(jié)果證實了Hsfl涉及SV40T-ag誘導(dǎo)腫瘤形成的調(diào)控,而SV40T-ag引起腫瘤的形成是通過調(diào)控p53和pRb蛋白的表達。 目的 1.觀察Hsfl表達的缺失在SV40T-ag誘導(dǎo)腫瘤形成中的作用。 2.探討Hsfl能夠刺激SV40T-ag引起腫瘤的形成,是否通過調(diào)控p53和pRb蛋白的表達引起。 方法 1.質(zhì)粒的構(gòu)建：鼠Hsfl的cDNA與N末端的Flag-tag在EcoRI亞克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pWZL-blast,形成重組質(zhì)粒pWZL-blast-Flag-hsfl,重建MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞系。質(zhì)粒pWZL-blast-Flag-hsfl瞬時轉(zhuǎn)染293Phoenix細胞,轉(zhuǎn)染后48小時,收集含有病毒顆粒的上清,感染SV40T-ag轉(zhuǎn)化的MEF/Hsfl-/-細胞。選用含3ug/ml的blasticitidine(?)勺培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞3-4天,Hsfl重新進入MEF/Hsfl-/-細胞,建成MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞系。將人Hsfl的shRNA構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLTHR,形成pLTHR-shRNA-Hsfl,shRNA瞬時轉(zhuǎn)染進入H1299和HEK293T細胞,沉默Hsfl基因的表達。 2.通過體外細胞克隆形成實驗,MTT實驗,流式細胞術(shù),裸鼠皮下移植瘤實驗分析SV40T-ag轉(zhuǎn)化的WT/MEF細胞,MEF/Hsfl-/-細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞的增殖和腫瘤的形成。 3.用免疫組織化學(xué)的方法檢測VEGF.CD34和FⅧ.RAg在WT/MEF細胞,MEF/Hsfl-/-細胞和MEF/Hsfl-/-Hsfl細胞形成移植瘤組織中的表達,判斷Hsfl在腫瘤血管形成中是否有作用。 4.通過免疫印跡實驗,用合適的抗體研究Hsfl,SV40T-ag,p53,pRb,HSP90, HSP70,HSP25等蛋白的表達；通過免疫共沉淀實驗觀察SV40T-ag與HSP70,pRb或p53的相互作用。 結(jié)果 1.重建MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞系 為了避免WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-細胞之間同胎仔畜的差異,我們用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達鼠Hsfl全長的cDNA感染MEF/Hsfl-/-細胞,重建MEF/Hsfl-/-/sfl細胞系。通過western blot實驗,結(jié)果證實Flag-Hsfl在MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞中有表達,在WT/MEF細胞中出現(xiàn)內(nèi)源性Hsfl的表達,而在MEF/Hsfl-/-細胞中沒有Hsfl的表達。 2.Hsfl的缺失抑制MEF/Hsfl-/-細胞的增生 通過MTT實驗和細胞克隆形成實驗,觀察WT/MEF細胞、MEF/Hsfl-/-細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞三種細胞的增殖情況。我們的實驗結(jié)果證明,MEF/Hsfl-/-細胞明顯比WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞生長的慢(T test,P0.05), WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞之間沒有明顯差異(T test,P＞0.05).細胞克隆實驗結(jié)果證實,MEF/Hsnfl-/-細胞形成的克隆明顯比WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞少(t-test,P0.001)。此外,通過流式細胞術(shù),我們分析這三種細胞系的細胞周期,發(fā)現(xiàn)在G0/G1期,WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-Hsfl細胞的百分?jǐn)?shù)明顯低于MEF/Hsfl-/-細胞(T test,P0.01):但是,在S期和G2/M期,WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞的百分?jǐn)?shù)明顯高于MEF/Hsfl-/-細胞(T test. P0.05)。我們的實驗結(jié)果證實,Hsfl參與了調(diào)控SV40T-ag轉(zhuǎn)化的MEF細胞的增殖。 3.Hsfl的缺失能夠抑制MEF細胞形成裸鼠成纖維細胞瘤的生長 為了探討Hsfl在腫瘤形成中是否有作用,將三種MEF細胞系接種到裸鼠皮下。在接種裸鼠26天后,三種MEF細胞系都能形成腫瘤。然而,WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞移植瘤的生長明顯比MEF/Hsfl-/-細胞快；WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞移植瘤的重量和體積明顯比MEF/Hsfl-/-細胞重和體積大(Ttest,P0.05).在WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞接種移植瘤的裸鼠中出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶,而MEF/Hsfl-/-細胞形成腫瘤的裸鼠中沒有發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。然而,VEGF. CD34和FⅧ.RAg在WT/MEF細胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞形成瘤組織中的表達明顯多于MEF/Hsfl-/-細胞形成的腫瘤(T test,P0.05).所有這些結(jié)果證明,Hsfl對SV40T-ag誘導(dǎo)的腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用,但是對腫瘤的起始沒有作用。 4. Hsfl與p53和Rb蛋白的表達有關(guān) SV40T-ag轉(zhuǎn)化細胞是通過SV40T-ag與p53和pRb的結(jié)合,滅活p53和pRb的活性。由于Hsfl的缺失能夠抑制SV40T-ag轉(zhuǎn)化細胞的生長,導(dǎo)致細胞周期阻止在G1/G0期。因此,我們推測Hsfl可能與p53和Rb信號通路有關(guān)。我們的western blotting實驗結(jié)果顯示,與WT/MEF和MEF/Hsfl-/-/THsfl細胞及裸鼠瘤組織相比,在MEF/Hsfl-/-細胞和裸鼠瘤組織中Rb,p53,p21,HSP25和SV40T-ag的表達是上調(diào)的(T test,P0.05);但是,在三種MEF細胞和腫瘤組織中Hsp70, hsp90和Hsc70的表達沒有變化(T test,P0.05)。為了探討Hsfl對p53和Rb的調(diào)控作用,我們用shRNA技術(shù)沉默HEK293T細胞中Hsfl的表達,HEK293T細胞表達SV40T-ag,結(jié)果顯示,沉默Hsfl的HEK293T細胞出現(xiàn)p53,pRb和SV40T-ag蛋白表達的上調(diào)(T test,P0.05)。結(jié)果顯示,Hsfl涉及調(diào)控p53, pRb和SV40T-ag蛋白的表達。為了研究p53, pRb和SV40T-ag之間的相關(guān)性,我們瞬時轉(zhuǎn)染shRNA-Hsfl和SV40T-ag進入H1299細胞,H1299細胞是p53陰性的細胞,這對于研究Hsfl對Rb和SV40T-ag的作用更加方便。我們的結(jié)果顯示,沉默Hsfl的H1299細胞導(dǎo)致Rb和SV40T-ag蛋白的表達上調(diào)(T test,P0.05)。上述結(jié)果顯示,Hsfl具有調(diào)控p53和pRb蛋白的表達。 SV40T-ag是一種能夠與p53和pRb結(jié)合引起細胞轉(zhuǎn)化的癌蛋白。在Hsfl缺失細胞中p53, pRb和SV40T-ag皆上調(diào),提示這三種蛋白之間的相互作用存在著某些錯誤。我們的免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染scramble shRNA的HEK293T細胞相比,在Hsfl沉默的HEK293T細胞中SV40T-ag和p53,SV40T-ag和pRb之間的相互作用弱�？傊�,我們的研究結(jié)果顯示,Hsfl缺失能夠調(diào)控p53,Rb和SV40T-ag蛋白的表達,破壞SV40T-ag與p53或pRb的相互作用,抑制細胞的增殖。 結(jié)論 1.重新構(gòu)建pWZL-blast-Flag-Hsfl和MEF/Hsfl-/-/Hsfl細胞系,有助于搞清楚Hsfl在SV40T-ag誘導(dǎo)腫瘤形成中的作用。 2. Hsfl表達的缺失不能阻斷SV40T-ag轉(zhuǎn)化細胞形成腫瘤,但是可以抑制腫瘤的生長。 3. Hsfl的缺失引起腫瘤組織中血管生成的減少,上調(diào)p53, pRb和SV40T-ag蛋白的表達,破壞SV40T-ag與p53或pRB蛋白的結(jié)合,結(jié)果抑制了SV40T-ag轉(zhuǎn)化細胞和腫瘤的生長。
[Abstract]:Background
鐑紤鍏嬭漿褰曞洜瀛，

本文編號：1921074