發(fā)布時(shí)間：2018-05-20 19:20

  本文選題：福氏志賀菌 + 雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：志賀菌(Shigella)為革蘭陰性菌,是細(xì)菌性痢疾的病原體,主要通過(guò)糞一口途徑傳播,侵入結(jié)腸粘膜。在我國(guó),細(xì)菌性痢疾是發(fā)病率僅次于病毒性肝炎和肺結(jié)核的第三大傳染病,血清型以福氏2a型為主。近年來(lái),由于抗生素的不規(guī)范使用以及耐藥基因的水平傳播,志賀菌在臨床上呈現(xiàn)多重耐藥,對(duì)青霉素類(lèi)、磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)抗生素耐藥率極高,甚至對(duì)喹諾酮類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)等目前臨床常用藥物的耐藥率也不斷上升,因此需要研究新的治療策略加以應(yīng)對(duì)。以抑制細(xì)菌毒力為思路可為新治療策略的研究提供理論依據(jù)。志賀菌侵襲宿主細(xì)胞、在細(xì)胞間擴(kuò)散并釋放毒素,是其致病過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其毒力與它的黏附力、侵襲力、腸毒素、調(diào)控蛋白等有關(guān),涉及多種致病因子,其中PhoP-PhoQ對(duì)志賀菌毒力的調(diào)控起重要作用,但其對(duì)毒力的調(diào)控機(jī)制不清楚,有待深入研究。 本課題的目的為研究福氏志賀菌PhoP-PhoQ雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)其毒力的調(diào)控機(jī)制。本研究首先對(duì)課題組前期篩選出的PhoQ抑制劑對(duì)福氏志賀菌Sf301毒力的影響進(jìn)行研究：通過(guò)HeLa細(xì)胞福氏志賀菌侵襲實(shí)驗(yàn)和小鼠角結(jié)膜志賀菌感染實(shí)驗(yàn),研究PhoQ抑制劑對(duì)福氏志賀菌毒力的影響,并利用Real-timePCR比較PhoQ抑制劑作用前后福氏志賀菌相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平。在此基礎(chǔ)上,利用同源重組技術(shù)構(gòu)建福氏志賀菌Sf301株phoP-phoQ雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因突變株,利用已HeLa細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及豚鼠角結(jié)膜感染實(shí)驗(yàn),比Sf矽301與phoP-phoQ敲除突變株的毒力變化。同時(shí),利用Real-time PCR比較Sf301與phoP-phoQ突變株毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,探討PhoP-PhoQ雙組分系統(tǒng)對(duì)志賀菌毒力的調(diào)節(jié)作用。 第一章PhoP-PhoQ雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析 鑒于PhoP-PhoQ雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在志賀菌中普遍存在,我們對(duì)志賀菌PhoP-PhoQ雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。Shigella flexneri2a str.301中phoQ基因與其它6株志賀菌株的同源性均大于99%；在其它革蘭陰性菌中,Shigella flexneri2a str.301與Escherichia coli及Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi的同源性均大于76%。PhoQ在革蘭陰性菌中表達(dá)雙組分系統(tǒng)中的感應(yīng)蛋白,蛋白全長(zhǎng)包含486aa,編碼跨膜的組氨酸蛋白激酶,PhoQ的氨基酸序列在志賀菌中的同源性大于99%；在其它革蘭陰性菌中的同源性大于85%。Shigella flexneri2a str.301中phoP基因與其它6株志賀菌株的同源性均大于98%；在其它革蘭陰性菌中,Shigella flexneri2a str.301與Escherichia coli及Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi的同源性均大于80%。PhoP在革蘭陰性菌中表達(dá)雙組分系統(tǒng)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白,蛋白全長(zhǎng)包含223aa,編碼胞內(nèi)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白,PhoP氨基酸序列在志賀菌中的同源性大于98%,在其它革蘭陰性菌中的同源性大于80%。而與革蘭陽(yáng)性菌的同源性小于32%。 第二章phoQ抑制劑對(duì)福氏志賀菌毒力的影響 PhoQ蛋白具有調(diào)控福氏志賀菌毒力的作用,在前期實(shí)驗(yàn)中,本課題組以PhoQ為藥物靶標(biāo)篩選獲得4個(gè)PhoQ抑制劑,在此基礎(chǔ)上,本研究通過(guò)HeLa細(xì)胞志賀菌侵襲實(shí)驗(yàn)和小鼠角結(jié)膜福氏志賀菌感染實(shí)驗(yàn),研究了PhoQ抑制劑對(duì)福氏志賀菌毒力的影響。 首先我們檢測(cè)了4個(gè)PhoQ抑制劑對(duì)福氏志賀菌生長(zhǎng)的影響：分別將終濃度為100μmol/L的PhoQ抑制劑加入Sf9380培養(yǎng),每隔1h測(cè)定sf9380的CFU,連續(xù)測(cè)定12h。結(jié)果顯示,4個(gè)PhoQ抑制劑對(duì)Sf9380的生長(zhǎng)均沒(méi)有影響。 在此基礎(chǔ)上,我們建立了福氏志賀菌感染HeLa細(xì)胞模型：將抑制劑(100μmo/L)與福氏志賀菌Sf9380共同培養(yǎng)4h、6h、8h后加入HeLa細(xì)胞,侵襲60min后去除細(xì)菌,加入慶大霉素以殺滅細(xì)胞外的細(xì)菌。去除慶大霉素后,加入Triton X-100釋放出侵襲入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌,取一定量的Triton X-100涂板后培養(yǎng),計(jì)算出平板上的細(xì)菌,得到侵襲入細(xì)胞的細(xì)菌總數(shù)與侵襲細(xì)胞的細(xì)菌總數(shù)的比值來(lái)表示侵襲率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PhoQ抑制劑與細(xì)菌共同培養(yǎng)4h時(shí)抑制劑對(duì)福氏志賀菌的侵襲力沒(méi)有抑制作用；與細(xì)菌共同培養(yǎng)6h時(shí),PhoQ抑制劑對(duì)福氏志賀菌的侵襲力有一定的抑制作用；與細(xì)菌共同培養(yǎng)8h時(shí),PhoQ抑制劑對(duì)福氏志賀菌的侵襲力有明顯的抑制作用。在確定了抑制劑與細(xì)菌相互作用的時(shí)間后,我們選取與PhoQ抑制劑作用8h后的福氏志賀菌Sf9380作為實(shí)驗(yàn)菌株,侵襲60min后,研究PhoQ抑制劑1、2、3和4對(duì)福氏志賀菌Sf9380侵襲力的抑制作用。結(jié)果顯示：福氏志賀菌Sf9380經(jīng)抑制劑1(12.5μmol/L)、2(25μmol/L)、3(100μmol/L)作用后,對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲率均有顯著下降(p0.01);抑制劑4(100μmol/L)不能抑制Sf93S0對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲力。進(jìn)一步為了驗(yàn)證篩選出的PhoQ抑制劑對(duì)細(xì)菌侵襲力的影響,我們選取了與福氏志賀菌PhoQ同源性較高的沙門(mén)菌作為實(shí)驗(yàn)菌株,研究PhoQ抑制劑對(duì)沙門(mén)菌侵襲HeLa細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制劑1、2、3均能抑制沙門(mén)菌對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲(p0.01)侵襲率分別為0.89×10-2、1.564×10-2、0.036×10-2,而抑制劑4則不能抑制沙門(mén)菌對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲,侵襲率為5.7×10-2,沙門(mén)菌的侵襲率為6×10-2。 我們采用小鼠角結(jié)膜志賀菌感染模型,比較了PhoQ抑制劑1、2、3和4對(duì)福氏志賀菌Sf9380毒力的抑制作用：將PhoQ抑制劑與福氏志賀菌Sf9380共同培養(yǎng)8h后,取3×108的細(xì)菌滴入小鼠角膜內(nèi),于感染后24h、48h、72h、96h分別觀察小鼠角結(jié)膜感染情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抑制劑1(12.5umol/L)、2(25umol/L)和4(100umol/L)能夠明顯抑制Sf9380所引起的小鼠角結(jié)膜炎癥反應(yīng),降低24h和48h時(shí)的急性角膜結(jié)膜炎癥程度,并加快炎癥恢復(fù)速度,72h后炎癥明顯減弱(P0.05)；抑制劑3(100umol/L)在24h可降低炎癥程度(P0.05)但不能減弱48h時(shí)的炎癥程度。 進(jìn)一步,我們利用Real-time PCR方法研究PhoQ抑制劑對(duì)Sf9380毒力相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,結(jié)果表明與未經(jīng)抑制劑處理的Sf9380相比,經(jīng)抑制劑1(12.5μmol/L)、2(25μmol/L)和3(100μmol/L)處理的Sf9380中,ipaA、 ipaB、ipaC、ipaD、ipaH、mxiA、virB及virF的轉(zhuǎn)錄水平均下降,而經(jīng)抑制劑4(100μmol/L)處理的Sf9380中,ipaA、ipaB、ipaC、ipaD、ipaH、mxiA、virB及virF的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化。研究結(jié)果提示,PhoQ抑制劑可以一定程度的抑制福氏志賀菌的毒力,且PhoP-PhoQ雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)福氏志賀菌毒力具有重要的調(diào)控作用。 第三章phoP-phoQ對(duì)福氏志賀菌毒力的影響 PhoP-PhoQ雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是沙門(mén)菌和大腸桿菌等革蘭陰性菌中的一個(gè)重要的毒力調(diào)控單元,可調(diào)控多種毒力基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在研究PhoQ抑制劑對(duì)福氏志賀菌侵襲HeLa細(xì)胞的影響中,我們?cè)诎l(fā)現(xiàn)PhoQ抑制劑能夠抑制福氏志賀菌對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲力,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)Sf301野生株對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲力較低。因此,我們首先對(duì)Sf301野生株的毒力進(jìn)行恢復(fù),以便于下一步毒力的比較：我們利用在易感動(dòng)物中連續(xù)傳代以提高細(xì)菌毒力的方法,將Sf301野生株在易感動(dòng)物豚鼠角膜內(nèi)連續(xù)傳代,以提高其毒力。經(jīng)豚鼠角膜內(nèi)的2次傳代,5/301的毒力明顯提高：接種細(xì)菌48h后出現(xiàn)膿性分泌物,72h后角膜表面混濁,呈灰白色,評(píng)分由“++”提高到“+++”。在此基礎(chǔ)上,我們比較Sf301與Sf301毒力恢復(fù)株(Sf301Fv)的生物學(xué)特性。與Sf301相比,Sf301Fv的生長(zhǎng)曲線(xiàn)有所改變：Sf301Fv在1-2h為延遲期,3-4h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期,5-6h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,7-8h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期,9-12h為平臺(tái)期。Sf301則在1-2h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期,3-6h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,7-8h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期,9h-12h為平臺(tái)期。通過(guò)HeLa細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)比較Sf301與Sf301Fv的毒力：與Sf301株相比,Sf301Fv對(duì)HeLa的侵襲力由5×10-6提高到2.6×10-3。進(jìn)一步我們比較Sf301與Sf301Fv在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期、中期、晚期的毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示毒力相關(guān)基因的變化較明顯：cpxA、icsA (virG)、ipaA、ipaB、ipaC、 mxiA、 phoR、 slyA、virB、virF、wzzE、ycfC轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)明顯；envZ、ipaD、ompC、ompF、rep轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。結(jié)果表明Sf301經(jīng)易感豚鼠傳代,毒力相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了改變,所獲得的5/301Fv毒力明顯提高,可以用于研究phoP-phoQ對(duì)福氏志賀菌毒力影響。 在恢復(fù)了5/301野生株毒力的基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了福氏志賀菌phoP-phoQ敲除株。由于對(duì)5/301野生株進(jìn)行毒力恢復(fù)后,Sf301的一些毒力基因發(fā)生變化,為了明確phoP-phoQ對(duì)福氏志賀菌毒力的影響,我們對(duì)Sf301及Sf301Fv分別進(jìn)行phoP-phoQ的敲除。我們利用pSB890質(zhì)粒構(gòu)建phoP-phoQ敲除質(zhì)粒：根據(jù)NCBI公布的Sf301的基因組序列(NC_004337),設(shè)計(jì)ΔphoP-phoQ的上下游同源臂。由于Sf301及Sf301Fv對(duì)pSB890攜帶的Tet抗性基因耐藥,故需要在敲除質(zhì)粒中加入抗性基因。在篩選了抗生素的基礎(chǔ)上,我們首先構(gòu)建了含有phoP-phoQ基因上下游片段(同源臂)的敲除質(zhì)粒pSB89ΔAphoP-phoQ。在此基礎(chǔ)上,將amp抗性基因插入質(zhì)粒pSB89ΔAphoP-phoQ中,構(gòu)建質(zhì)粒pSBS9ΔAphoP-phoQ-amp。進(jìn)一步通過(guò)兩次同源重組得至phoP-phoQ敲除株。 在構(gòu)建了Sf301ΔphoP-phoQ與Sf301Fv ΔphoP-phoQ的基礎(chǔ)上,我們比較了Sf301、Sf301ΔphoP-phoQ、Sf301Fv及Sf301Fv ΔphoP-phoQ的生長(zhǎng)情況：Sf301Fv與Sf301Fv ΔphoP-phoQ的生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似,在1-2h為延遲期,3-4h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期,5-6h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,7-8h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期,9-12h為平臺(tái)期；Sf301與Sf301ΔphoP-phoQ的生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似,均在1-2h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期,3-6h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期,7-8h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期,9h-12h為平臺(tái)期。在此基礎(chǔ)上我們比較Sf301、Sf301ΔphoP-phoQ,Sf301Fv及Sf301Fv ΔphoP-phoQ的生化特性：與Sf301相比,Sf301ΔphoP-phoQ的ARA(阿拉伯糖)的反應(yīng)由陽(yáng)性變?yōu)殛幮?同時(shí)Sf301Fv與Sf301Fv ΔphoP-phoQ也有相似的改變,其余反應(yīng)Sf301與Sf301ΔphoP-phoQ, Sf301Fv與Sf301Fv ΔphoP-phoQ均相似。進(jìn)一步我們比較兩對(duì)敲除株的耐藥性：與Sf301Fv相比,Sf301Fv ΔphoP-phoQ對(duì)萘啶酮酸及鏈霉素的耐藥性提高,對(duì)頭孢他啶、頭孢噻肟的耐藥性下降,這與Sf301與Sf301Δ Δphop-phoQ的改變相似。 在此基礎(chǔ)上利用已建立的HeLa侵襲實(shí)驗(yàn),分別比較Sf301與Sf301Δphop-phoQ及Sf301Fv與Sf301Fv ΔphoP-phoQ對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲力,結(jié)果以侵襲入細(xì)胞的細(xì)菌總數(shù)與侵襲細(xì)胞的細(xì)菌總數(shù)的比值來(lái)表示。結(jié)果顯示,與Sf301Fv相比,Sf301Fv ΔphoP-phoQ對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲力明顯下降,由2.6×10-3下降到4.9×10-5。這與Sf301與Sf301ΔphoP-phoQ改變的趨勢(shì)一致。同時(shí),我們通過(guò)豚鼠角結(jié)膜感染實(shí)驗(yàn),觀察豚鼠角結(jié)膜炎的嚴(yán)重程度,比較Sf301與Sf301ΔphoP-phoQ及Sf301Fv與Sf301Fv ΔphoP-phoQ對(duì)豚鼠角結(jié)膜的侵襲力。感染過(guò)程中分別觀察24h、48h及72h豚鼠角結(jié)膜感染情況并評(píng)分。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Sf301Fv相比,Sf301Fv ΔphoP-phoQ對(duì)豚鼠角膜的感染力明顯下降,Sf301Fv ΔphoP-phoQ沒(méi)有引起豚鼠的角膜炎癥,評(píng)分由“+++”下降為“一”。這與Sf301株與Sf301ΔphoP-phoQ改變的趨勢(shì)一致：與Sf301相比,Sf301ΔphoP-phoQ對(duì)豚鼠角膜的感染力明顯下降,不能引起豚鼠的角結(jié)膜炎,而Sf301引起的豚鼠角結(jié)膜炎較嚴(yán)重,有膿性分泌物。 在觀察了Sf301與Sf301ΔphoP-phoQ及Sf301Fv與Sf301Fv ΔphoP-phoQ的生物學(xué)特性和毒力變化后,我們分別比較Sf301與Sf301ΔphoP-phoQ及Sf301Fv與Sf301Fv ΔphoP-phoQ在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期、中期、晚期的毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明毒力相關(guān)基因的變化較明顯,轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)的基因有：icsA(virG)、ipaA、ipaB、ipaC、ipaD、mxiA、ompC、virB,轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化的基因有：cpxA、ipaH、ompF、ompR、phoB、slyA、sodB、wzzE、ycfC。提示phoP-phoQ通過(guò)對(duì)一些毒力相關(guān)基因的調(diào)控來(lái)影響志賀菌的毒力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R378.25

【共引文獻(xiàn)】

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8 李，

本文編號(hào)：1915915