本文選題：沙門菌 + 質(zhì)粒��； 參考：《蘇州大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：目的：通過建立沙門菌感染的細(xì)胞模型,觀察傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98及與其密切相關(guān)的沙門菌質(zhì)粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene B, spvB)對(duì)自噬及感染結(jié)局的影響,探討其發(fā)生機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路,以期揭示沙門菌質(zhì)粒毒力基因增強(qiáng)宿主菌毒力的分子機(jī)制,為探索通過調(diào)控細(xì)胞自噬水平控制沙門菌感染的新途徑,并為后續(xù)新藥靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及疫苗開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法： 1.沙門菌質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞自噬及感染結(jié)局的影響。以攜帶質(zhì)粒PRST98的傷寒沙門菌(Salmonella typhi, S.typhi)野生株ST8為實(shí)驗(yàn)株,消除pRST98的突變株P(guān)RST98為陰性對(duì)照株,攜帶沙門菌質(zhì)粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene, spv)的鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)毒株(Salmonella typhimurium)SR-11為陽性對(duì)照株,將受試菌與野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(wide type mouse embryonic fibroblasts, WT-MEFs)及自噬基因5缺陷型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(autophagy associated gene5deficient mouse embryonic fibroblasts, Atg5-/-MEFs)體外共培養(yǎng),制作細(xì)胞感染模型。以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為100：1感染細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立WT-MEFs的自噬激動(dòng)劑——雷帕霉素(rapamycin, RAPA)干預(yù)組。將細(xì)胞與細(xì)菌共作用1h后吸取上清,此時(shí)定為“0"點(diǎn),加入含有100μg/ml的阿米卡星(Amikacin, AMK)培養(yǎng)液作用2h以去除胞外菌,然后將AMK濃度降為10μg/ml以抑制從感染細(xì)胞中釋放至培養(yǎng)液中的細(xì)菌生長(zhǎng)。分別在感染的不同時(shí)間段(1h、3h、5h、8h和10h)收獲細(xì)胞,采用以下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：①單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin, MDC)染色,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)狀自噬囊泡；②透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察細(xì)胞內(nèi)雙層或多層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體；③Western Blotting (WB)檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白——微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(Microtubule-associated protein1light chain3-Ⅱ, MAP1-LC3-Ⅱ,即LC3-Ⅱ)表達(dá)情況；④Annexin.V-FITC/Propidium Iodide (Ann.V/PI)雙染流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)分析細(xì)胞凋亡率；⑤梯度稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)胞內(nèi)集落形成單位(colony forming unit, CFU)。 2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB影響細(xì)胞自噬及機(jī)制研究。以spvB缺陷的鼠傷寒沙門菌SR-11突變株(SR-11-△spvB)及含有spvB的野生型鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)毒株SR-11(SR-11)為研究對(duì)象,將實(shí)驗(yàn)菌株體外感染W(wǎng)T-MEFs及Atg5-/-MEFs, MOI為100：1,細(xì)胞感染過程同第一部分。分別在感染的不同時(shí)間段(1h、3h、5h、8h和10h)收獲細(xì)胞,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①WB檢測(cè)細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白、磷脂酶D(phospholipase D1——PLD1和phospholipase D2——PLD2)蛋白及Toll樣受體4(Toll-like receptors4, TLR4)蛋白表達(dá)情況；②放射性[9,103H]油酸標(biāo)記檢測(cè)感染細(xì)胞的PLD活性；③逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞TLR4信使RNA (messanger RNA, mRNA)表達(dá)情況；④Ann.V/PI雙染FCM分析細(xì)胞凋亡率；⑤酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)細(xì)胞Thl型細(xì)胞因子干擾素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)及Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4(interleukin-4, IL-4)和白細(xì)胞介素-13(interleukin-13, IL-13)的表達(dá)；⑥梯度稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)胞內(nèi)CFU。 結(jié)果： 1.沙門菌質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞自噬及感染結(jié)局的影響 (1) MDC熒光染色結(jié)果：ST8及SR-11感染的各組細(xì)胞中,在感染早期,WT-MEFs內(nèi)可見很少量的點(diǎn)狀自噬囊泡顆粒,RAPA干預(yù)后,WT-MEFs在感染早期1h點(diǎn)狀自噬囊泡顆粒數(shù)量增多。感染早期1h,ST8-△pRST98感染的WT-MEFs出現(xiàn)大量的點(diǎn)狀自噬囊泡顆粒,3h時(shí)顆粒數(shù)量減少,RAPA干預(yù)的ST8-ApRsT98感染W(wǎng)T-MEFs在早期亦出現(xiàn)數(shù)量眾多的自噬囊泡顆粒。 (2)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察：在感染早期1h, ST8及SR-11感染的WT-MEFs內(nèi)未見自噬小體,RAPA干預(yù)后,ST8及SR-11感染的WT-MEFs胞內(nèi)可見雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。感染早期1h,電鏡下可見ST8-△pRST98感染的WT-MEFs及RAPA干預(yù)的WT-MEFs內(nèi)有典型的雙層或多層膜自噬小體。 (3) LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)：在感染早期1h,ST8及SR-11感染W(wǎng)T-MEFs的LC3-Ⅱ表達(dá)較弱,RAPA干預(yù)后,ST8及SR-11感染W(wǎng)T-MEFs的LC3-Ⅱ表達(dá)明顯增強(qiáng)。感染中晚期5h-10h, LC3-Ⅱ在上述各組感染細(xì)胞均不表達(dá)。感染早期1h和3h,ST8-△pRST98感染的WT-MEFs的LC3-Ⅱ表達(dá)較強(qiáng),且LC3-Ⅱ在1h的表達(dá)強(qiáng)度高于3h; RAPA干預(yù)WT-MEFs后,LC3-Ⅱ表達(dá)明顯增加。 (4)3株細(xì)菌感染的Atg5-/-MEFs在感染各時(shí)間段均沒有觀察到點(diǎn)狀自噬囊泡顆粒、雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體及LC3-Ⅱ表達(dá)等自噬現(xiàn)象發(fā)生。 (5)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：ST8感染的各組細(xì)胞中,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之間凋亡率無顯著性差異,RAPA干預(yù)WT-MEFs后,其凋亡率明顯降低。SR-11感染各組細(xì)胞的凋亡比較結(jié)果與ST8感染細(xì)胞類似,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之間凋亡率無顯著性差異,在以RAPA干預(yù)后,WT-MEFs凋亡率顯著降低。ST8-△pRST98感染的各組細(xì)胞凋亡結(jié)果分析顯示,在各個(gè)時(shí)間段,Atg5-/-MEFs凋亡率最高,RAPA干預(yù)的WT-MEFs凋亡率高于RAPA未干預(yù)的WT-MEFs凋亡率。 (6)梯度稀釋法計(jì)數(shù)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量：ST8感染的各組細(xì)胞之間,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs的胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量無顯著性差異,而RAPA干預(yù)的WT-MEFs胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著低于RAPA未干預(yù)WT-MEFs組。SR-11感染各組細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量比較結(jié)果與ST8感染細(xì)胞類似,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之間無顯著性差異,RAPA干預(yù)后,WT-MEFs內(nèi)細(xì)菌數(shù)量明顯減少。ST8-△pRsT98感染的各組細(xì)胞比較結(jié)果顯示,Atg5-/-MEFs胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量最多,RAPA干預(yù)的WT-MEFs與RAPA未干預(yù)的WT-MEFs之間無顯著性差異。 2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB影響細(xì)胞自噬及機(jī)制研究 (1)感染細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)情況：在感染早期1h和3h, SR-11感染W(wǎng)T-MEFs的LC3-Ⅱ表達(dá)明顯弱于SR-11-△spvB感染的WT-MEFs,在感染中后期5h～10h,LC3-Ⅱ均不表達(dá)。 (2)感染細(xì)胞PLD1和PLD2蛋白表達(dá)情況：在各時(shí)間段,SR-11感染細(xì)胞的PLD1蛋白表達(dá)水平強(qiáng)于SR-11-△spvB感染細(xì)胞,而PLD2蛋白表達(dá)水平在兩株細(xì)菌感染細(xì)胞之間無顯著性差異。 (3)感染細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)情況：在感染各時(shí)間段,SR-11感染細(xì)胞的TLR4蛋白表達(dá)水平明顯弱于SR-11-△spvB感染細(xì)胞。 (4)感染細(xì)胞PLD活性測(cè)定：SR-11及SR-11-△spvB感染細(xì)胞的PLD活性均明顯高于空白細(xì)胞的PLD基礎(chǔ)活性；在感染各時(shí)間段,SR-11感染細(xì)胞的PLD活性均高于SR-11-△spvB感染細(xì)胞,1h達(dá)到高峰,以后逐漸下降。 (5)感染細(xì)胞TLR4mRNA表達(dá)情況：在感染各時(shí)間段,SR-11感染細(xì)胞的TLR4mRNA表達(dá)水平低于SR-11-△spvB感染細(xì)胞。 (6)感染細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：在感染各時(shí)間段,SR-11-△spvB感染的WT-MEFs凋亡率顯著低于SR-11感染的WT-MEFs及SR-11-△spvB感染的Atg5-/-MEFs凋亡率；SR-11感染的WT-MEFs與Atg5-/-MEFs之間,凋亡率無顯著性差異。 (7)感染細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)情況：感染早期和中期(1h～5h),SR-11感染細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)水平低于SR-11-△spvB感染細(xì)胞組,而SR-11感染細(xì)胞的IL-4及IL-13表達(dá)明顯高于SR-11-△spvB感染細(xì)胞組；在感染后期(8h～10h),兩株細(xì)菌感染細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)無顯著性差異。 (8)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)檢測(cè)：SR-11感染的WT-MEFs及Atg5-/-MEFs之間胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量無顯著性差異。SR-11-△spvB感染W(wǎng)T-MEFs的胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著低于SR-11-△spvB感染的Atg5-/-MEFs和SR-11感染的WT-MEFs胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)。 結(jié)論： 1.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98可通過抑制細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖,從而加重細(xì)胞損傷。 2.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98抑制自噬的作用與其基因序列上的重要毒力基因spvB密切相關(guān)。spvB可通過抑制細(xì)胞TLR4表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞PLD1表達(dá)及增加PLD活性,抑制Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-13表達(dá)從而導(dǎo)致Th1/Th2免疫漂移等途徑抑制細(xì)胞自噬。spvB抑制自噬的信號(hào)通路與絲氨酸／蘇氨酸激酶(serine/threonine protein kinase, AKT)依賴性方式激活TOR激酶(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)密切相關(guān)。 3.作用于mTOR靶點(diǎn)的藥物——雷帕霉素可減弱沙門菌質(zhì)粒毒力基因?qū)ψ允傻囊种谱饔?從而增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)感染病原菌的殺傷能力,減輕細(xì)胞損傷。 4.自噬在沙門菌感染中具有“雙刃劍”的作用,適度激活有利于清除胞內(nèi)感染病原菌,減輕細(xì)胞損傷；而其缺失、抑制或過度增強(qiáng)可加重細(xì)胞損傷和感染。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of Salmonella typhimurium plasmid pST98 and Salmonella plasmid virulence gene B , spvB on the outcome of autophagy and infection by establishing a cell model of Salmonella infection , and to explore its mechanism and relevant signal pathways , in order to reveal the molecular mechanism of the virulence gene of Salmonella typhimurium , and to explore the new way to control the infection of Salmonella by regulating the autophagy level of cells .

Method :


and its deletion , inhibition or overexpression may aggravate cell damage and infection .
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378.22

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳淑燕;李瓊;儲(chǔ)元元;李Z腦，

本文編號(hào)：1905205