本文選題：沙門菌 + 質粒��； 參考：《蘇州大學》2012年博士論文

【摘要】：目的：通過建立沙門菌感染的細胞模型,觀察傷寒沙門菌質粒pRST98及與其密切相關的沙門菌質粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene B, spvB)對自噬及感染結局的影響,探討其發(fā)生機制及相關信號通路,以期揭示沙門菌質粒毒力基因增強宿主菌毒力的分子機制,為探索通過調控細胞自噬水平控制沙門菌感染的新途徑,并為后續(xù)新藥靶點的發(fā)現及疫苗開發(fā)提供實驗和理論依據。 方法： 1.沙門菌質粒對細胞自噬及感染結局的影響。以攜帶質粒PRST98的傷寒沙門菌(Salmonella typhi, S.typhi)野生株ST8為實驗株,消除pRST98的突變株PRST98為陰性對照株,攜帶沙門菌質粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene, spv)的鼠傷寒沙門菌標準毒株(Salmonella typhimurium)SR-11為陽性對照株,將受試菌與野生型小鼠胚胎成纖維細胞(wide type mouse embryonic fibroblasts, WT-MEFs)及自噬基因5缺陷型小鼠胚胎成纖維細胞(autophagy associated gene5deficient mouse embryonic fibroblasts, Atg5-/-MEFs)體外共培養(yǎng),制作細胞感染模型。以對數生長期細菌按感染復數(multiplicity of infection, MOI)為100：1感染細胞,同時設立WT-MEFs的自噬激動劑——雷帕霉素(rapamycin, RAPA)干預組。將細胞與細菌共作用1h后吸取上清,此時定為“0"點,加入含有100μg/ml的阿米卡星(Amikacin, AMK)培養(yǎng)液作用2h以去除胞外菌,然后將AMK濃度降為10μg/ml以抑制從感染細胞中釋放至培養(yǎng)液中的細菌生長。分別在感染的不同時間段(1h、3h、5h、8h和10h)收獲細胞,采用以下方法進行實驗檢測：①單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin, MDC)染色,熒光顯微鏡下觀察細胞內點狀自噬囊泡；②透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察細胞內雙層或多層膜結構的自噬小體；③Western Blotting (WB)檢測細胞自噬標志蛋白——微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(Microtubule-associated protein1light chain3-Ⅱ, MAP1-LC3-Ⅱ,即LC3-Ⅱ)表達情況；④Annexin.V-FITC/Propidium Iodide (Ann.V/PI)雙染流式細胞術(flow cytometry, FCM)分析細胞凋亡率；⑤梯度稀釋平板菌落計數法檢測胞內集落形成單位(colony forming unit, CFU)。 2.沙門菌質粒毒力基因spvB影響細胞自噬及機制研究。以spvB缺陷的鼠傷寒沙門菌SR-11突變株(SR-11-△spvB)及含有spvB的野生型鼠傷寒沙門菌標準毒株SR-11(SR-11)為研究對象,將實驗菌株體外感染WT-MEFs及Atg5-/-MEFs, MOI為100：1,細胞感染過程同第一部分。分別在感染的不同時間段(1h、3h、5h、8h和10h)收獲細胞,進行以下實驗：①WB檢測細胞LC3-Ⅱ蛋白、磷脂酶D(phospholipase D1——PLD1和phospholipase D2——PLD2)蛋白及Toll樣受體4(Toll-like receptors4, TLR4)蛋白表達情況；②放射性[9,103H]油酸標記檢測感染細胞的PLD活性；③逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測細胞TLR4信使RNA (messanger RNA, mRNA)表達情況；④Ann.V/PI雙染FCM分析細胞凋亡率；⑤酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測細胞Thl型細胞因子干擾素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)及Th2型細胞因子白細胞介素-4(interleukin-4, IL-4)和白細胞介素-13(interleukin-13, IL-13)的表達；⑥梯度稀釋平板菌落計數法檢測胞內CFU。 結果： 1.沙門菌質粒對細胞自噬及感染結局的影響 (1) MDC熒光染色結果：ST8及SR-11感染的各組細胞中,在感染早期,WT-MEFs內可見很少量的點狀自噬囊泡顆粒,RAPA干預后,WT-MEFs在感染早期1h點狀自噬囊泡顆粒數量增多。感染早期1h,ST8-△pRST98感染的WT-MEFs出現大量的點狀自噬囊泡顆粒,3h時顆粒數量減少,RAPA干預的ST8-ApRsT98感染WT-MEFs在早期亦出現數量眾多的自噬囊泡顆粒。 (2)細胞超微結構觀察：在感染早期1h, ST8及SR-11感染的WT-MEFs內未見自噬小體,RAPA干預后,ST8及SR-11感染的WT-MEFs胞內可見雙層膜結構的自噬小體。感染早期1h,電鏡下可見ST8-△pRST98感染的WT-MEFs及RAPA干預的WT-MEFs內有典型的雙層或多層膜自噬小體。 (3) LC3-Ⅱ蛋白表達：在感染早期1h,ST8及SR-11感染WT-MEFs的LC3-Ⅱ表達較弱,RAPA干預后,ST8及SR-11感染WT-MEFs的LC3-Ⅱ表達明顯增強。感染中晚期5h-10h, LC3-Ⅱ在上述各組感染細胞均不表達。感染早期1h和3h,ST8-△pRST98感染的WT-MEFs的LC3-Ⅱ表達較強,且LC3-Ⅱ在1h的表達強度高于3h; RAPA干預WT-MEFs后,LC3-Ⅱ表達明顯增加。 (4)3株細菌感染的Atg5-/-MEFs在感染各時間段均沒有觀察到點狀自噬囊泡顆粒、雙層膜結構的自噬小體及LC3-Ⅱ表達等自噬現象發(fā)生。 (5)細胞凋亡檢測結果：ST8感染的各組細胞中,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之間凋亡率無顯著性差異,RAPA干預WT-MEFs后,其凋亡率明顯降低。SR-11感染各組細胞的凋亡比較結果與ST8感染細胞類似,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之間凋亡率無顯著性差異,在以RAPA干預后,WT-MEFs凋亡率顯著降低。ST8-△pRST98感染的各組細胞凋亡結果分析顯示,在各個時間段,Atg5-/-MEFs凋亡率最高,RAPA干預的WT-MEFs凋亡率高于RAPA未干預的WT-MEFs凋亡率。 (6)梯度稀釋法計數胞內細菌數量：ST8感染的各組細胞之間,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs的胞內細菌數量無顯著性差異,而RAPA干預的WT-MEFs胞內細菌數量顯著低于RAPA未干預WT-MEFs組。SR-11感染各組細胞的胞內細菌數量比較結果與ST8感染細胞類似,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之間無顯著性差異,RAPA干預后,WT-MEFs內細菌數量明顯減少。ST8-△pRsT98感染的各組細胞比較結果顯示,Atg5-/-MEFs胞內細菌數量最多,RAPA干預的WT-MEFs與RAPA未干預的WT-MEFs之間無顯著性差異。 2.沙門菌質粒毒力基因spvB影響細胞自噬及機制研究 (1)感染細胞LC3-Ⅱ蛋白表達情況：在感染早期1h和3h, SR-11感染WT-MEFs的LC3-Ⅱ表達明顯弱于SR-11-△spvB感染的WT-MEFs,在感染中后期5h～10h,LC3-Ⅱ均不表達。 (2)感染細胞PLD1和PLD2蛋白表達情況：在各時間段,SR-11感染細胞的PLD1蛋白表達水平強于SR-11-△spvB感染細胞,而PLD2蛋白表達水平在兩株細菌感染細胞之間無顯著性差異。 (3)感染細胞TLR4蛋白表達情況：在感染各時間段,SR-11感染細胞的TLR4蛋白表達水平明顯弱于SR-11-△spvB感染細胞。 (4)感染細胞PLD活性測定：SR-11及SR-11-△spvB感染細胞的PLD活性均明顯高于空白細胞的PLD基礎活性；在感染各時間段,SR-11感染細胞的PLD活性均高于SR-11-△spvB感染細胞,1h達到高峰,以后逐漸下降。 (5)感染細胞TLR4mRNA表達情況：在感染各時間段,SR-11感染細胞的TLR4mRNA表達水平低于SR-11-△spvB感染細胞。 (6)感染細胞凋亡率檢測：在感染各時間段,SR-11-△spvB感染的WT-MEFs凋亡率顯著低于SR-11感染的WT-MEFs及SR-11-△spvB感染的Atg5-/-MEFs凋亡率；SR-11感染的WT-MEFs與Atg5-/-MEFs之間,凋亡率無顯著性差異。 (7)感染細胞的細胞因子表達情況：感染早期和中期(1h～5h),SR-11感染細胞的IFN-γ表達水平低于SR-11-△spvB感染細胞組,而SR-11感染細胞的IL-4及IL-13表達明顯高于SR-11-△spvB感染細胞組；在感染后期(8h～10h),兩株細菌感染細胞的細胞因子表達無顯著性差異。 (8)胞內細菌數檢測：SR-11感染的WT-MEFs及Atg5-/-MEFs之間胞內細菌數量無顯著性差異。SR-11-△spvB感染WT-MEFs的胞內細菌數量顯著低于SR-11-△spvB感染的Atg5-/-MEFs和SR-11感染的WT-MEFs胞內細菌數。 結論： 1.傷寒沙門菌質粒pRST98可通過抑制細胞自噬促進細菌在宿主細胞內的存活和增殖,從而加重細胞損傷。 2.傷寒沙門菌質粒pRST98抑制自噬的作用與其基因序列上的重要毒力基因spvB密切相關。spvB可通過抑制細胞TLR4表達,促進細胞PLD1表達及增加PLD活性,抑制Th1型細胞因子IFN-γ、促進Th2型細胞因子IL-4和IL-13表達從而導致Th1/Th2免疫漂移等途徑抑制細胞自噬。spvB抑制自噬的信號通路與絲氨酸／蘇氨酸激酶(serine/threonine protein kinase, AKT)依賴性方式激活TOR激酶(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)密切相關。 3.作用于mTOR靶點的藥物——雷帕霉素可減弱沙門菌質粒毒力基因對自噬的抑制作用,從而增強宿主細胞對感染病原菌的殺傷能力,減輕細胞損傷。 4.自噬在沙門菌感染中具有“雙刃劍”的作用,適度激活有利于清除胞內感染病原菌,減輕細胞損傷；而其缺失、抑制或過度增強可加重細胞損傷和感染。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of Salmonella typhimurium plasmid pST98 and Salmonella plasmid virulence gene B , spvB on the outcome of autophagy and infection by establishing a cell model of Salmonella infection , and to explore its mechanism and relevant signal pathways , in order to reveal the molecular mechanism of the virulence gene of Salmonella typhimurium , and to explore the new way to control the infection of Salmonella by regulating the autophagy level of cells .

Method :


and its deletion , inhibition or overexpression may aggravate cell damage and infection .
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R378.22

【參考文獻】

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1 吳淑燕;李瓊;儲元元;李Z腦，

本文編號：1905205