本文選題：KLF4 + RARα��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的:維生素A的衍生物全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)在多種細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和誘導(dǎo)分化的作用。維甲酸受體(retinoic acid receptor, RAR)是一類重要的核受體,有RARα、RARβ和RARγ三種亞型。該類受體通過與其相應(yīng)的配體ATRA相結(jié)合,激活或抑制多種基因的表達(dá),從而在細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。Krüppel樣因子4(krüppel-like factor, GKLF/KLF4)是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子,對血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)具有抑制增殖、誘導(dǎo)分化的作用。 大量的實驗結(jié)果表明,在VSMC中,ATRA可以顯著誘導(dǎo)KLF4基因的表達(dá),但目前ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚。本研究探討ATRA激活KLF4基因表達(dá)的機(jī)制,研究RARα及相關(guān)的信號通路在ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)過程中的作用,以期明確ATRA誘導(dǎo)VSMC分化的分子基礎(chǔ)。 方法:用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠VSMC,胰蛋白酶消化傳代,取3～5代細(xì)胞進(jìn)行實驗。Western blot分析檢測ATRA對KLF4和RARα表達(dá)的影響,應(yīng)用不同信號通路抑制劑研究介導(dǎo)KLF4表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 結(jié)果: 1 ATRA誘導(dǎo)KLF4和RARα表達(dá) 以10μM ATRA刺激VSMC 0、6、12、24 h后,提取細(xì)胞總蛋白和RNA,分別進(jìn)行Western blot分析和RT-PCR。結(jié)果顯示,隨著ATRA刺激時間的延長,KLF4的表達(dá)水平呈時間依賴性升高,同時RARα表達(dá)水平亦顯著增高,提示RARα可能參與ATRA誘導(dǎo)KLF4的表達(dá)。 2 RARα介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的KLF4表達(dá) 應(yīng)用RARα拮抗劑Ro 41-5253(20μM)預(yù)處理VSMC 1 h后,ATRA(10μM)刺激VSMC 24 h,分別提取細(xì)胞總蛋白和RNA,進(jìn)行Western blot分析和RT-PCR。結(jié)果顯示,應(yīng)用RARα抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后,ATRA上調(diào)KLF4表達(dá)的作用受到抑制。為了進(jìn)一步驗證RARα是否介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的KLF4表達(dá),將RARα的特異性小干擾RNA(RARα-siRNA)導(dǎo)入VSMC,阻斷內(nèi)源性RARα表達(dá)后,檢測KLF4的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染RARα-siRNA的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染NS-siRNA的對照組相比,ATRA對KLF4表達(dá)的誘導(dǎo)作用被抑制,表明RARα介導(dǎo)ATRA對KLF4表達(dá)的誘導(dǎo)作用。 3 ATRA激活p38 MAPK、抑制ERK信號通路 為了探討ATRA通過哪些信號途徑激活KLF4基因表達(dá),應(yīng)用ATRA(10μM),刺激VSMC 0、15、30、60 min后,分別檢測ERK、p38 MAPK、Akt及β-catenin的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA刺激15 min后,ERK的磷酸化水平降低,p38 MAPK的磷酸化水平顯著升高,ATRA刺激不影響Akt和β-catenin的磷酸化水平。表明ATRA能夠抑制ERK信號通路,激活p38 MAPK通路。 4 RARα通過ERK和p38 MAPK信號調(diào)節(jié)KLF4基因表達(dá) 為了進(jìn)一步探討RARα在ATRA誘導(dǎo)KLF4基因表達(dá)中的作用,應(yīng)用RARα拮抗劑Ro 41-5253預(yù)處理VSMC 1 h后, ATRA刺激VSMC 1 h。Western blot分析發(fā)現(xiàn),ERK磷酸化水平與對照組相比明顯升高,p38磷酸化水平顯著降低。此外,應(yīng)用RARα-siRNA轉(zhuǎn)染VSMC,敲低內(nèi)源性RARα表達(dá)后,ERK磷酸化水平與對照組相比升高,p38 MAPK磷酸化水平顯著降低,表明RARα通過ERK和p38 MARK信號調(diào)節(jié)KLF4基因表達(dá)。 5 p38 MAPK信號介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的KLF4表達(dá) 為了進(jìn)一步證明ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)與p38 MAPK和ERK信號通路的相關(guān)性,分別用p38 MAPK特異性抑制劑SB203580(20μM),ERK抑制劑PD98059(20μM)及Akt抑制劑LY294002(20μM)預(yù)孵育VSMC 2 h后,給予ATRA刺激24 h,收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示,抑制p38 MAPK信號途徑可使ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)的作用受到抑制,抑制ERK信號途徑上調(diào)KLF4表達(dá),抑制Akt信號途徑不影響ATRA對KLF4表達(dá)的誘導(dǎo)作用。為了進(jìn)一步驗證ERK信號途徑在ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)中的作用,應(yīng)用ERK的持續(xù)活化型質(zhì)粒pCMV-MEKca轉(zhuǎn)染VSMC,ATRA刺激細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞檢測KLF4的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pCMV-MEKca的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒(pCMV)的細(xì)胞相比,ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)的作用受到抑制。以上結(jié)果表明,p38 MAPK和ERK信號通路在ATRA調(diào)節(jié)KLF4基因表達(dá)中發(fā)揮重要的作用。 結(jié)論: 1在VSMC中,ATRA誘導(dǎo)KLF4和RARα表達(dá)。 2 RARα介導(dǎo)ATRA對KLF4基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用。 3 RARα通過ERK和p38 MAPK信號途徑調(diào)節(jié)ATRA誘導(dǎo)的KLF4基因表達(dá)。
[Abstract]:Objective : All trans retinoic acid ( ATRA ) , a derivative of vitamin A , plays an important role in regulating cell growth and inducing differentiation in a variety of cells . The retinoic acid receptor ( RARs ) plays an important role in the process of cell proliferation , differentiation and apoptosis . The Kr眉ppel - like factor ( GKLF / KLF4 ) is a kind of nuclear transcription factor containing zinc finger structure .


A large number of experimental results show that ATRA can induce KLF4 gene expression significantly , but the molecular mechanism of ATRA - induced KLF4 expression is not clear . This study explores the mechanism of ATRA activation of KLF4 gene expression , and studies the role of RAR偽and related signal pathway in ATRA - induced KLF4 expression , with a view to clarifying the molecular basis of ATRA - induced differentiation of KLF4 .


Methods : The effects of ATRA on the expression of KLF4 and RAR偽were detected by Western blot , and the signal transduction pathway of KLF4 expression was studied by Western blot .


Results :


1 . ATRA - induced KLF4 and RAR偽expression


The total protein and RNA were extracted by Western blot and RT - PCR respectively . The results showed that the expression level of KLF4 increased in time - dependent manner with the prolongation of ATRA stimulation time , and the level of RAR偽was also significantly increased , suggesting that RAR偽might participate in ATRA - induced expression of KLF4 .


KLF4 expression induced by RAR偽mediated ATRA


After pretreatment with RAR偽 inhibitor Ro 41 - 5253 ( 20 渭M ) , the effects of ATRA ( 10 渭M ) on the expression of KLF4 by ATRA ( 10 渭M ) were inhibited .


3 ATRA activates p38 MAPK and inhibits ERK signaling pathway


The phosphorylation level of ERK , p38 MAPK , and 尾 - catenin was detected by ATRA ( 10 渭M ) . The phosphorylation level of ERK , p38 MAPK , and 尾 - catenin was significantly increased after 15 min of ATRA stimulation . The phosphorylation level of p38 MAPK was significantly increased , and ATRA stimulation did not affect the phosphorylation of ERK and 尾 - catenin , suggesting that ATRA could inhibit ERK signaling pathway and activate p38 MAPK pathway .


4 RAR偽regulates KLF4 gene expression via ERK and p38 MAPK signaling


In order to further study the role of RAR偽in ATRA - induced KLF4 gene expression , it was found that the phosphorylation of ERK increased significantly compared with the control group after 1 h treatment with RAR偽 antagonist Ro 41 - 5253 . The phosphorylation level of ERK increased significantly compared with the control group , and the phosphorylation level of ERK increased significantly , and the phosphorylation level of p38 MAPK was significantly decreased , indicating that RAR偽regulated KLF4 gene expression via ERK and p38 MARK .


5 - p38 MAPK signal - mediated induction of ATRA - induced KLF4 expression


In order to further demonstrate that ATRA - induced KLF4 expression was associated with p38 MAPK and ERK signaling pathways , the effect of ATRA on KLF4 expression was inhibited by the inhibition of p38 MAPK specific inhibitor SB203580 ( 20 渭M ) , ERK inhibitor PD98059 ( 20 渭M ) , and the expression of KLF4 by ATRA . The results showed that inhibition of ERK signaling pathway inhibited the expression of KLF4 by ATRA . The results showed that inhibition of ERK signaling pathway inhibited the expression of KLF4 . The results showed that p38 MAPK and ERK signaling pathway played an important role in the regulation of KLF4 gene expression in ATRA .


Conclusion :


1 . ATRA induced KLF4 and RAR偽expression .


2 RAR偽mediated the induction of ATRA on KLF4 gene expression .


3 RAR偽regulates the expression of KLF4 gene induced by ATRA via ERK and p38 MAPK signaling pathway .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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本文編號：1888435