本文選題：單純皰疹病毒2型 + 多功能蛋白ICP27�。� 參考：《華南理工大學》2011年碩士論文

【摘要】：單純皰疹病毒2型(HSV-2)是一種常見的人類至病菌,感染人腰部以下的皮膚和粘膜而主要引起生殖器皰疹。HSV-2感染人體后,便能在骶尾神經節(jié)內建立終身性的潛伏感染,而潛伏的病毒可因多種因素而激活,經外周感覺神經順向移至皮膚粘膜表面發(fā)生皮損。目前,臨床上用抗病毒藥物來治療HSV-2的感染,但不能徹底清除潛伏感染的病毒,且尚未研制出能安全有效預防HSV-2感染的疫苗。究其原因在于潛伏-復發(fā)的機制不明確。 ICP27是HSV IE基因編碼的一種磷酸化蛋白,由512個氨基酸殘基組成,分子量約為63kDa,是一種非常重要的病毒基因表達調節(jié)因子。在HSV感染期間表現出多種功能：在細胞質與細胞核間來回穿梭而將病毒mRNAs運輸至細胞質中、抑制Ⅰ型干擾素信號而有利于病毒逃避宿主免疫監(jiān)視、調節(jié)病毒一系列早期及晚期基因的表達而有利于病毒的增殖等。在潛伏感染期間,HSV基因為環(huán)狀,而潛伏的病毒可因多種刺激而激活。為維持潛伏感染的狀態(tài),病毒感染細胞的凋亡作用應被阻止,LATs據報道能保護神經細胞而不發(fā)生凋亡。而ICP27在病毒的激活過程中可以激活p38與JNK信號通路而使細胞發(fā)生凋亡。因此,ICP27被認為在病毒的激活過程中起著重要的作用。 為此,我們提取了病毒的基因組并以此為模板,用特異性的引物PCR擴增出ICP27片段。雙酶切后,T4連接酶連接ICP27片段與真核表達質粒pEGFPC2而獲得重組子,雙酶切及測序鑒定后將重組質粒命為pEGFP-ICP27。接下來,將重組質粒pEGFP-ICP27瞬時轉染Vero細胞,48h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況,并收集細胞提取總RNA及總蛋白,RT-PCR及western blot分別檢測ICP27在Vero細胞中的轉錄及表達情況。PEGFP-ICP27在轉染后的24h-48h之間,在Vero細胞中的表達量最大。 pEGFP-ICP27轉染Vero細胞后,MTT法檢測發(fā)現其活性明顯低于轉染pEGFPC2及空白轉染的Vero細胞活性；Giemsa染色后發(fā)現轉染pEGFP-ICP27的Vero細胞變圓,細胞核破裂,與之相對應的是凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的活性明顯高于轉染pEGFPC2及空白對照；熒光定量PCR檢測Bax、Bcl-2 mRNAs的變化,轉染重組質粒的Vero細胞中Bax mRNAs表達量略有上調,Bcl-2 mRNAs表達量降低,Bax/Bcl-2明顯高于正常培養(yǎng)的Vero細胞及轉染pEGFPC2質粒的Vero細胞。 基于以上這些實驗結果,我們可以認為HSV-2 ICP27具有促進細胞凋亡的作用,而這種作用可能是使Bax及Bcl-2在細胞中的比例發(fā)生變化而導致的。
[Abstract]:Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) is a common human pathogen that infects skin and mucous membranes below the waist and causes mainly genital herpes. HSV-2 infection in the sacrococcygeal ganglion can establish a lifelong latent infection. The latent virus can be activated by many factors, and the skin lesions occur through peripheral sensory nerves. At present, antiviral drugs are used to treat HSV-2 infection in clinic, but the latent infection virus can not be completely eliminated, and no vaccine has been developed to prevent HSV-2 infection safely and effectively. The reason is that the mechanism of latent-recurrence is not clear. ICP27 is a phosphorylated protein encoded by HSV IE gene. It is composed of 512 amino acid residues and its molecular weight is about 63kDa. It is a very important regulatory factor for viral gene expression. During HSV infection, virus mRNAs was transported to the cytoplasm by shuttling back and forth between cytoplasm and nucleus, which inhibited the signal of interferon type I and facilitated the virus to escape from host immune surveillance. Regulating the expression of a series of early and late genes is beneficial to virus proliferation. During latent infection, HSV bases are circular and latent viruses can be activated by multiple stimuli. In order to maintain the latent infection, the apoptosis of virus-infected cells should be prevented by LATs, which is reported to protect nerve cells from apoptosis. ICP27 can activate p38 and JNK signaling pathway and induce apoptosis. Therefore, ICP 27 is thought to play an important role in the activation of viruses. Therefore, we extracted the genome of the virus and used it as a template to amplify the ICP27 fragment with specific primer PCR. The recombinant plasmid was obtained by ligating the ICP27 fragment with the eukaryotic expression plasmid pEGFPC2. The recombinant plasmid was designated as pEGFP-ICP27 after double enzyme digestion and sequencing. After transient transfection of recombinant plasmid pEGFP-ICP27 into Vero cells for 48 h, the expression of green fluorescent protein (GFP) was observed under fluorescence microscope. Total RNA, total protein RT-PCR and western blot were collected to detect the transcription and expression of ICP27 in Vero cells. PEGFP-ICP27 was expressed most in Vero cells after transfection with 24h-48h. The activity of pEGFP-ICP27 transfected Vero cells was significantly lower than that of Vero cells transfected with pEGFPC2 and blank transfected Vero cells. The Vero cells transfected with pEGFP-ICP27 became round and the nucleus ruptured. The activity of apoptotic executive protein Caspase-3 was significantly higher than that of transfected pEGFPC2 and blank control, and the changes of Bcl-2 mRNAs were detected by fluorescence quantitative PCR. The expression of Bax mRNAs in Vero cells transfected with recombinant plasmid was slightly up-regulated. The expression of Bax-Bax / Bcl-2 was significantly higher than that of Vero cells cultured in normal culture and Vero cells transfected with pEGFPC2 plasmids. Based on these results, we can conclude that HSV-2 ICP27 can promote apoptosis, which may be due to the change of the proportion of Bax and Bcl-2 in cells.
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R373

【共引文獻】

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