本文選題：融合蛋白 + 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原��； 參考：《中國藥學(xué)雜志》2017年20期

【摘要】：目的建立重組細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA4)-Fc融合蛋白的質(zhì)控方法。方法應(yīng)用基于CTLA4/IL-2-Luciferace/Jurkat細(xì)胞(簡稱Jurkat細(xì)胞)的報告基因法檢測重組CTLA4-Fc融合蛋白的生物學(xué)活性;表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)測定重組CTLA4-Fc融合蛋白與B7的結(jié)合活性測定法;分子排阻高效液相色譜(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)、毛細(xì)管凝膠電泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)進(jìn)行純度分析;等電聚焦電泳(isoelectric focusing,IEF)進(jìn)行電荷異質(zhì)性分析;肽圖法和毛細(xì)管膠束電動色譜(micellar electrokinetic chromatography,MEKC)進(jìn)行鑒別試驗;反相高效液相色譜(reversed phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)進(jìn)行唾液酸含量測定;親水高效液相色譜(hydrophilic high performance liquid chromatography,HILIC-HPLC)進(jìn)行N糖型含量測定等,對重組CTLA4-Fc融合蛋白進(jìn)行了質(zhì)量研究。結(jié)果重組CTLA4-Fc融合蛋白的生物學(xué)活性EC_(50)值為(0.40±0.08)μg·mL~(-1),RSD為20.00%;BIAcore測定與B7相對結(jié)合活性為參比品的(91.72±0.12)%,RSD為0.14%;SEC-HPLC分析的純度為(99.09±0.01)%,RSD為0.01%;還原CE-SDS分析的純度為(100.00±0.00)%,非還原CE-SDS單體為(98.50±0.17)%,RSD為0.18%;IEF等電點主區(qū)帶p I范圍為4.6~5.9;肽圖法中供試品與參比品一致;MEKC可對重組CTLA4-Fc融合蛋白及其變體進(jìn)行有效鑒別;唾液酸含量為(10.16±0.41)mol/mol蛋白,RSD為4.07%;N糖主要糖型的含量:G0F含量為7.5%,G1F含量為15.0%,G2F含量為17.1%,G1FS1含量為4.2%,G2FS1含量為19.5%,G2FS2含量為9.6%。結(jié)論建立了重組CTLA4-Fc融合蛋白的關(guān)鍵質(zhì)量屬性評價方法,上述方法為抗體融合蛋白類生物制品的質(zhì)量控制提供參考。
[Abstract]:Objective to establish a method for quality control of recombinant cytotoxic T lymphocyte associated antigen (4(CTLA4)-Fc) fusion protein. Methods the biological activity of recombinant CTLA4-Fc fusion protein was detected by reporter gene method based on CTLA4/IL-2-Luciferace/Jurkat cells (Jurkat cells), and the binding activity of recombinant CTLA4-Fc fusion protein to B7 was determined by surface plasmon resonance assay (SPR). The purity was analyzed by capillary electrophoresis sodium dodecyl gel electrophoresis (Capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate CE-SDS), the charge heterogeneity was analyzed by isoelectric focusing electrophoresis (isoelectric focusing IEF), the identification test was carried out by peptide map method and micellar electrokinetic chromatographyMEKC by capillary micellar electrokinetic chromatography (MEC). The quality of recombinant CTLA4-Fc fusion protein was studied by reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and hydrophilic high performance liquid chromatographyHILIC-HPLC. the content of sialic acid was determined by reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Results the biological activity of the recombinant CTLA4-Fc fusion protein was 0.40 鹵0.08 渭 g / mL, RSD = 20.00%. The relative binding activity of B7 to B7 was determined by BIAcore. The RSD was 0.14 鹵0.12. The purity of CE-SDS was 0.01; the purity of CE-SDS was 100.00 鹵0.005; the purity of non-reducing CE-SDS was 98.50 鹵0.17; the purity of CE-SDS was 0.1850 鹵0.17; the purity of CE-SDS was 100.00 鹵0.005; the purity of non-reducing CE-SDS was 98.50 鹵0.17; the purity of CE-SDS was 0.01; the purity of reductive CE-SDS was 100.00 鹵0.005; and the purity of non-reducing CE-SDS was 98.50 鹵0.17. The pI range of the main zone was 4.6 ~ 5.9.The recombinant CTLA4-Fc fusion protein and its variants could be effectively identified by MEKC in the same way as the reference protein in the peptide map method. The content of sialic acid was 10.16 鹵0.41)mol/mol protein and the content of main sugar forms was 7.5G0F was 7.5. G1F was 15.0and G2F was 17.1G1FS1 was 4.2G2FS1 was 19.5G2FS2 was 9.6. Conclusion A method for evaluating the key quality attributes of recombinant CTLA4-Fc fusion protein is established, which provides a reference for the quality control of antibody fusion protein biological products.
【作者單位】： 中國食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定及標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室;
【基金】：國家重點研發(fā)計劃課題資助項目(2016YCF1200904)
【分類號】：R392-33

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本文編號：1871203