本文選題：剛地弓形蟲 + 核苷三磷酸水解酶-Ⅱ��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會致病性原蟲,在人和動物的有核細(xì)胞內(nèi)寄生和繁殖,引起人獸共患的弓形蟲病。尤其對于孕婦、嬰兒和免疫低下者感染后危害極大。目前已成為發(fā)展中國家乃至全世界關(guān)注的機(jī)會感染性疾病之一。弓形蟲在宿主體內(nèi)快速增殖以及所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致宿主機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的組織損傷和臨床癥狀。雖然許多抗生素對急性弓形蟲病治療有效,但這些藥物本身會對患者產(chǎn)生一定的副作用。因此,找到一種新藥,特別是一種既能抑制弓形蟲增殖又幾乎不會產(chǎn)生副作用的藥物成為弓形蟲病治療的當(dāng)務(wù)之急。 弓形蟲侵入宿主細(xì)胞后位于一個由納蟲泡膜包繞的納蟲泡內(nèi),位于納蟲泡內(nèi)的蟲體可通過分泌一些蛋白成分修飾納蟲泡內(nèi)環(huán)境,從而維持自身生長發(fā)育需求。其中,核苷三磷酸脫氫酶(nucleoside triphosphate hydrolase, NTPase)是弓形蟲適應(yīng)宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境獲得嘌呤的寄生機(jī)制而產(chǎn)生,對弓形蟲在寄生、繁殖方面具有重要意義。由于弓形蟲屬于嘌呤營養(yǎng)缺陷型,無法通過從頭途徑合成嘌呤堿基,因此,為了生存和繁殖,弓形蟲只能通過補(bǔ)救合成途徑直接從宿主細(xì)胞獲取嘌呤。弓形蟲NTPase蛋白存在于速殖子體膜表面,但當(dāng)速殖子侵入宿主細(xì)胞不久,NTPase即分泌入納蟲泡的網(wǎng)狀管腔系統(tǒng)內(nèi),在二巰基化合物(如DTT)的激活作用下,能連續(xù)水解所有的三磷酸核苷和三磷酸脫氧核苷至單磷酸形式。感染宿主細(xì)胞的弓形蟲速殖子即是利用NTPase分解宿主細(xì)胞來源的ATP,以合成維持自身生存所必需的嘌呤核苷酸。 弓形蟲NTPase蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ兩種亞型。編碼NTPase基因組DNA無內(nèi)含子,由3個連續(xù)排列的開放讀碼框架(ORF)組成,分別為NTP1、NTP2和NTP3。其中NTP2不具備編碼蛋白的能力,而NTPase-Ⅰ、NTPase-Ⅱ是分別與編碼基因NTP3和NTP1相對應(yīng)的一組同工酶。其中NTPase-Ⅰ僅存在于有毒株,而NTPase-Ⅱ幾乎存在于所有弓形蟲蟲株。顯而易見,以NTPase-Ⅱ蛋白作為藥物或疫苗靶點(diǎn)將比NTPase-Ⅰ蛋白具有更廣泛地應(yīng)用前景。 本研究將以原核表達(dá)的NTPase-Ⅱ蛋白免疫BALB/c小鼠,制備特異性抗弓形蟲核苷三磷酸水解酶(NTPase)Ⅱ型重組蛋白(rTgNTPase-Ⅱ)單克隆抗體,觀察所獲單克隆抗體的保護(hù)作用,闡明弓形蟲NTPase-Ⅱ在RH株速殖子生長發(fā)育中的作用。同時觀察rTgNTPase-Ⅱ免疫后,BALB/c小鼠體內(nèi)所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類型及免疫保護(hù)作用,為尋找新的疫苗靶點(diǎn)提供實(shí)驗依據(jù)。 1.弓形蟲NTPase-Ⅱ的基因克隆和蛋白表達(dá) 采用PCR方法擴(kuò)增得到剛地弓形蟲RH株NTPase基因,克隆入pGEM-T Easy載體,經(jīng)酶切與測序鑒定后亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒pBAD-HisB,成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pBAD-HisB-NTPase,轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中獲得高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物主要存在于包涵體中。融合蛋白的相對分子量(Mr)約70 kDa,與理論值相近。 使用Ni離子親和層析柱純化重組質(zhì)粒pBAD-HisB-NTPase表達(dá)產(chǎn)生的含組氨酸的重組蛋白,SDS-PAGE鑒定純度約為84%. Western blotting和ELISA分析結(jié)果顯示,純化的重組蛋白可被鼠抗重組蛋白血清特異性識別,具有良好的免疫反應(yīng)性和免疫原性。 2.抗弓形蟲rNTPase-Ⅱ單克隆抗體的制備及其功能分析 通過制備特異性抗弓形蟲核苷三磷酸水解酶(NTPase)Ⅱ型重組蛋白(rTgNTPase-Ⅱ)單克隆抗體,觀察所獲單克隆抗體的保護(hù)作用,以此闡明弓形蟲NTPase-Ⅱ在RH株速殖子生長發(fā)育中的作用。 將rTgNTPase-Ⅱ抗原(50μg/100μl)以福氏完全佐劑等體積混合后皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠,并以同樣劑量的rTgNTPase-Ⅱ抗原等體積混合福氏不完全佐劑后每隔2周進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫,一共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。最后一次加強(qiáng)免疫后3天取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,細(xì)胞融合率為92.71%(534/576)。利用純化的rTgNTPase-Ⅱ作為包括抗原,以間接ELISA法進(jìn)行篩選。對于篩選到的陽性克隆株以有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆,最終得到2株高親和力雜交瘤細(xì)胞系,分別命名為MNT1與MNT2。將得到的單克隆抗體注射經(jīng)降植烷處理的BALB/c小鼠腹腔,收集腹水以親和層析法進(jìn)行單抗純化。 2.1單克隆抗體的鑒定： 采用Sigma抗體亞型檢測試劑盒測定單克隆抗體的免疫球蛋白類別和亞類,證實(shí)2株單克隆抗體均為IgG2a亞類。間接ELISA法測定雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清與小鼠腹水效價,檢測結(jié)果表明,MNT1與MNT2細(xì)胞培養(yǎng)上清效價分別為1：12 800 and 1：6 400,而小鼠腹水效價分別為1：51200與1：12 800。同時將雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)傳代三個月及液氮凍存一個月后復(fù)蘇,不同時間取其培養(yǎng)液上清,用間接ELISA法檢測其抗體效價,測定抗體分泌的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)胞連續(xù)傳代三個月,分泌抗體的能力穩(wěn)定。液氮凍存一個月后復(fù)蘇,對細(xì)胞上清進(jìn)行檢測,抗體仍為陽性。以Western Blot法鑒定單克隆抗體的特異性,結(jié)果表明,兩株單克隆抗體與rTgNTPase-Ⅱ蛋白在約70kDa處出現(xiàn)反應(yīng)條帶,與弓形蟲RH株速殖子全蟲抗原在約63kDa處出現(xiàn)反應(yīng)條帶,均與預(yù)期結(jié)果相符。而與陰性對照(含pBAD-HisB載體的DE3細(xì)菌裂解液)之間未出現(xiàn)反應(yīng)條帶。最后,將純化的弓形蟲RH株速殖子分別與單克隆抗體或陰性對照反應(yīng)后,加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG,利用間接熒光抗體實(shí)驗(IFAT)于激光共聚焦顯微鏡下觀察NTPase-Ⅱ在速殖子中的定位,發(fā)現(xiàn)2株單克隆抗體均與弓形蟲RH株速殖子出現(xiàn)熒光反應(yīng)。 2.2單克隆抗體保護(hù)性實(shí)驗 2.2.1單克隆抗體抑制蟲體入侵與胞內(nèi)生長發(fā)育情況：將純化的弓形蟲RH株速殖子與單克隆抗體孵育后按照蟲株數(shù)：細(xì)胞數(shù)為2：1的比例,對COS-7宿主細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)。并于感染后3小時、9小時與15小時分別取出不同處理組于油鏡下進(jìn)行計數(shù)觀察。其中與單抗孵育3h的細(xì)胞培養(yǎng)孔中觀察100個宿主細(xì)胞中被速殖子感染的細(xì)胞數(shù)量(感染率),評價單抗對弓形蟲RH株速殖子入侵宿主細(xì)胞的抑制作用。同時分別計數(shù)與單抗孵育3h、9h、15h的細(xì)胞培養(yǎng)孔中100個感染速殖子的陽性細(xì)胞中弓形蟲蟲體數(shù)量(感染度),評價單克隆抗體對弓形蟲RH株在宿主細(xì)胞內(nèi)生長發(fā)育的抑制作用。感染3小時后的感染率檢測結(jié)果表明：MNT1、MNT2、IgG2a與完全培養(yǎng)液處理后的感染率分別為12%,10%,12%與13%,各組之間結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.458,P=0.928),表明2株單克隆抗體無抑制弓形蟲RH株速殖子入侵COS-7宿主細(xì)胞的能力。然而在速殖子感染9h(χ2=19.741,P=0.000)與15h(χ2=44.974,P=0.000)后,各處理組間感染度均存在顯著性差異,其中MNT1單克隆抗體處理組抑制蟲體在COS-7細(xì)胞中增殖的效果最好,MNT2單克隆抗體處理組次之。表明2株單克隆抗體均可顯著抑制弓形蟲RH株速殖子在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長發(fā)育。且MNT1單克隆抗體抑制作用更顯著。 2.2.2單克隆抗體抑制酶活性情況：將純化的弓形蟲RH株速殖子與單克隆抗體孵育后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中,以DTT刺激10分鐘后加入Triton X-100,對于速殖子裂解液上清進(jìn)行酶活性檢測,觀察單抗對酶活性的抑制作用。由于NTPase可水解ATP至ADP,同時釋放出無機(jī)磷(Pi)。通過檢測Pi濃度發(fā)現(xiàn),與對照組相比,MNT1單克隆抗體處理組(P=0.002)與MNT2單克隆抗體處理組Pi濃度均顯著降低(P=0.035),表明NTPase酶活性可被2株單克隆抗體顯著抑制。 2.2.3單克隆抗體被動免疫保護(hù)性實(shí)驗：將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組,分別標(biāo)記為MNT1-1、MNT1-2、MNT2-1、MNT2-2、IgG2a-1、IgG2a-2。將MNT1-1與MNT1-2兩組BALB/c小鼠均以腹腔接種0.2ml(500μg/ml)單克隆抗體MNT1,MNT1-1組于腹腔接種單克隆抗體當(dāng)天用200個RH株速殖子進(jìn)入攻擊感染,而MNT1-2組于接種48h后以同樣數(shù)量速殖子攻擊感染。MNT2組與IgG2a組根據(jù)組名接種不同單抗,其余操作步驟同上。密切觀察、記錄各組小鼠的死亡時間,評價單克隆抗體的被動免疫保護(hù)作用。結(jié)果表明,當(dāng)天攻擊感染的不同處理組間,其生存時間存在顯著性差異(χ2=14.708,P=0.001),與對照組相比,MNT1單克隆抗體處理組(P=0.004)和MNT2單克隆抗體處理組(P=0.018)小鼠的生存時間均顯著延長,而且,MNT1單克隆抗體處理組與MNT2單克隆抗體處理組中小鼠生存時間亦具有顯著性差異(P=0.004);同樣,48h后攻擊感染的不同處理組間的生存時間亦存在顯著性差異(χ2=6.531,P=0.038)。然而,盡管MNT1單克隆抗體處理組在48h后攻擊感染其生存時間比對照組顯著延長(P=0.030),MNT2單克隆抗體處理組與對照組之間無顯著性差異(P=0.189),表明應(yīng)用MNT1被動免疫后產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果更好,可顯著延長小鼠生存時間。本實(shí)驗為進(jìn)一步研發(fā)新弓形蟲疫苗提供了實(shí)驗依據(jù)。 3. rTgNTPase-Ⅱ?qū)蜗x感染的免疫保護(hù)及作用機(jī)制 通過觀察rTgNTPase-Ⅱ免疫后,BALB/c小鼠體內(nèi)所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類型及免疫保護(hù)作用,為尋找新的疫苗靶點(diǎn)提供實(shí)驗依據(jù)。將純化的rTgNTPase-Ⅱ蛋白進(jìn)行去內(nèi)毒素處理,并通過凝膠法檢測蛋白樣品中內(nèi)毒素含量,待樣品中內(nèi)毒素含量低于試劑盒最低檢測量0.03EU/ml時對SPF級BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。小鼠分為3組：聯(lián)合免疫組、rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組以及對照組,每組各20只。其中聯(lián)合免疫組以10μg的rTgNTPase-Ⅱ吸附0.5mg氫氧化鋁佐劑進(jìn)行聯(lián)合免疫,對照組為PBS混合氫氧化鋁佐劑進(jìn)行免疫。初次免疫后每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫,共加強(qiáng)免疫3次。待加強(qiáng)免疫結(jié)束后2周,對各免疫組小鼠進(jìn)行特異性IgG抗體實(shí)驗、細(xì)胞免疫反應(yīng)實(shí)驗及免疫保護(hù)作用研究。 3.1.體液免疫反應(yīng)評價： 以5μg/ml的rTgNTPase-Ⅱ為包被抗原建立間接ELISA法,檢測各免疫組小鼠血清中特異性總IgG抗體與IgG1、IgG2a兩個抗體亞類。結(jié)果顯示,聯(lián)合免疫組中抗rTgNTPase-Ⅱ總IgG抗體比rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組(P=0.000)和對照組(P=0.000)均顯著升高,而rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組與對照組相比亦顯著升高(P=0.000)。此外,與對照組相比,聯(lián)合免疫組小鼠血清中IgGl抗體亞類與IgG2a抗體亞類水平比rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組(P=0.005,P=0.005)和對照組(P=0.000,P=0.000)均顯著升高,而rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組與對照組相比亦顯著升高(P=0.000,P=0.000),提示rTgNTPase-Ⅱ所誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可能為Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)。然而,通過計算各rTgNTPase-Ⅱ免疫組中IgG1與IgG2a比值,我們可以發(fā)現(xiàn),rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組中所誘導(dǎo)產(chǎn)生的為Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答(IgG2a/IgG11),而聯(lián)合免疫組中所誘導(dǎo)產(chǎn)生的為Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答(IgG2a/IgG11),表明佐劑具有增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)的作用。 3.2.細(xì)胞免疫反應(yīng)評價 3.2.1淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗：最后一次加強(qiáng)免疫后2周,每組各取5只小鼠脾淋巴細(xì)胞,懸浮后按3×105/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,隨后以rTgNTPase-Ⅱ(10μg/ml)刺激體外培養(yǎng)的免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞,待孵育72小時后以CCK-8法檢測各孔吸光度,按以下公式計算刺激指數(shù)：刺激指數(shù)(SI)=刺激孔均值/對照組均值。以ConA作為陽性對照,完全培養(yǎng)液作為陰性對照。與對照組相比,聯(lián)合免疫組(P=0.000)與rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組(P=0.002)中,小鼠脾淋巴細(xì)胞均對rTgNTPase-Ⅱ刺激出現(xiàn)了顯著的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),但兩個免疫組之間差異并無顯著性(P=0.295)。 3.2.2細(xì)胞因子檢測：按上述方法得到小鼠脾淋巴細(xì)胞后,以5×106/孔鋪入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待孵育24小時后檢測培養(yǎng)上清中IL2、IL-4濃度,72小時后檢測IL-10濃度,96小時后檢測IFN-γ濃度。與對照組相比,聯(lián)合免疫組(P=0.000)與rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組(P=0.000)中小鼠脾淋巴細(xì)胞均對rTgNTPase-Ⅱ刺激產(chǎn)生了IFN-γ。同樣,聯(lián)合免疫組(P=0.002)與rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組(P=0.013)中小鼠脾淋巴細(xì)胞均對rTgNTPase-Ⅱ刺激產(chǎn)生了IL-2。然而卻只有聯(lián)合免疫組的細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10含量與對照組(P=0.021)和rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組(P=0.031)相比均出現(xiàn)顯著升高,而所有免疫組中均未檢測出IL-4。 3.2.3 T細(xì)胞亞群分析：按之前操作步驟分別獲取各免疫組5只小鼠脾臟,制備脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度約106/50μ1/管,每管加入3株熒光標(biāo)記的單克隆抗體：CD4(RM4-5)-FITC Rat Anti-Mouse、CD8a(53-6.7)-PE Rat Anti-Mouse和CD3e-PE-CYTM5 Hamster Anti-Mouse 20μl。暗室孵育后于流式細(xì)胞儀上計數(shù)10000個細(xì)胞,記錄CD3+CD4+CD8"和CD3+CD4-CD8+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),聯(lián)合免疫組(P=0.000)與rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組(P=0.000)中CD3+CD4+雙陽性T細(xì)胞/CD3+CD8+雙陽性T細(xì)胞的比值均顯著低于對照組。 3.3免疫保護(hù)作用評價 3.3.1急性攻擊感染：為觀察免疫小鼠對弓形蟲急性感染的免疫保護(hù)作用,在免疫結(jié)束后2周用1000個弓形蟲強(qiáng)毒株RH株速殖子于腹腔攻擊感染各免疫組小鼠,每組各感染5只,記錄各組小鼠生存時間。與對照組相比,聯(lián)合免疫組(P=0.021)與rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組(P=0.020)小鼠生存時間均顯著延長。 3.3.2慢性攻擊感染：為觀察各免疫組小鼠對弓形蟲慢性感染所產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用,將各組最后剩下的10只小鼠以弓形蟲弱毒株P(guān)RU株包囊經(jīng)口喂食攻擊感染,每只小鼠感染20個包囊。攻擊感染5周后,計數(shù)各免疫組小鼠腦組織中包囊數(shù)。結(jié)果顯示聯(lián)合免疫組(P=0.008)與rTgNTPase-Ⅱ單獨(dú)免疫組(P=0.014)腦組織包囊數(shù)均顯著減少,下降率分別為62.9%和57.6%。從而證實(shí)rTgNTPase-Ⅱ可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),該免疫反應(yīng)以Thl型細(xì)胞應(yīng)答為主。由rTgNTPase-Ⅱ誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可為BALB/c小鼠提供部分的免疫保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1863896