本文選題：啟動(dòng)子 + pfurAma�。� 參考：《蘇州大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病(tuberculosis)的病原菌,而卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)是全球公認(rèn)的唯一有效的結(jié)核疫苗。通過(guò)表達(dá)某些重要保護(hù)性抗原編碼基因來(lái)構(gòu)建重組卡介苗(recombinant bacillus Calmette-Guérin,rBCG)是改進(jìn)結(jié)核疫苗效力的重要方法之一。通常情況下,構(gòu)建的rBCG將抗原分泌至胞外或錨定于細(xì)胞外膜表面,可更為有效地遞呈并產(chǎn)生免疫反應(yīng)。目的:比較結(jié)核分枝桿菌(M. tb)突變型啟動(dòng)子pfurAma的突變體pfurAma-N和pfurAma-N3以及phsp60控制基因表達(dá)的活性,用以構(gòu)建分枝桿菌膜錨定表達(dá)載體,并分析外源目的蛋白的表達(dá)情況及其亞細(xì)胞定位分析。方法:PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子pfurAma突變體,并在其5'端額外引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)以便于信號(hào)序列或標(biāo)簽分子的克隆,并將導(dǎo)致的pfurAma-N(pfurAma啟動(dòng)子起始密碼子上游-3~-1位AGT→CAT突變)和pfurAma-N3(pfurAma啟動(dòng)子起始密碼子上游-1位增加三個(gè)密碼子CAT)分別亞克隆入探針載體pMC210,以pfurAma和phsp60啟動(dòng)子重組報(bào)告質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌mc2155,通過(guò)檢測(cè)胞外β-半乳糖苷酶活性評(píng)估啟動(dòng)子活性。然后選取最強(qiáng)的啟動(dòng)子pfurAma-N取代pMV261載體中的phsp60啟動(dòng)子,從而構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)載體pMFA42。隨后,人工合成帶有NdeⅠ和BamHⅠ粘性末端的結(jié)核分枝桿菌19 kDa抗原膜結(jié)合信號(hào)序列的正義鏈和反義鏈,退火后將其直接亞克隆至pMFA42載體中構(gòu)建膜錨定表達(dá)載體pMFA42M。PCR擴(kuò)增增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因,分別亞克隆至上述兩種不同類型的載體中并電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌(M.s),分別獲得重組EGFP融合胞內(nèi)表達(dá)菌株和膜錨定表達(dá)菌株;接著,將M. tb主要保護(hù)性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的編碼基因亞克隆入膜錨定表達(dá)載體pMFA42M中構(gòu)建M. tb抗原-EGFP融合表達(dá)菌株;通過(guò)Western-blot和流式細(xì)胞表面標(biāo)記技術(shù)來(lái)分析目的抗原的表達(dá)水平及其亞細(xì)胞定位,并進(jìn)一步通過(guò)熒光顯微鏡直接觀察重組EGFP融合表達(dá)菌株在體外和感染巨噬細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度。結(jié)果:成功擴(kuò)增出啟動(dòng)子突變體pfurAma-N和pfurAma-N3,啟動(dòng)子活性分析發(fā)現(xiàn)pfurAma啟動(dòng)子起始密碼子上游三位密碼子的突變并不影響啟動(dòng)子活性,pfurAma-N與pfurAma活性相當(dāng),均為phsp60活性的2倍左右;而增加啟動(dòng)子和起始密碼間的距離則將導(dǎo)致其活性顯著下降,pfurAma-N3活性僅為phsp60的一半。通過(guò)引入M. tb 19 kDa脂蛋白膜分泌信號(hào),在高效的啟動(dòng)子pfurAma-N的驅(qū)動(dòng)下,成功地構(gòu)建了分枝桿菌膜錨定表達(dá)載體。利用EGFP作為標(biāo)簽抗原,通過(guò)Western-blot、熒光顯微觀察和流式細(xì)胞表面標(biāo)記等技術(shù)均證實(shí)了外源目的抗原可在分枝桿菌中高水平表達(dá)并定位至細(xì)胞膜上。結(jié)論:本研究為重組BCG和分枝桿菌膜蛋白功能研究提供了一種新型的膜錨定表達(dá)載體,所構(gòu)建的EGFP重組表達(dá)菌株亦可作為一種模式示蹤菌為細(xì)胞吞噬和動(dòng)物免疫中的細(xì)菌定植和移位分析提供新的思路。
[Abstract]:Mycobacterium tuberculosism is the cause of tuberculosis, and BCG is the only effective tuberculosis vaccine in the world. The construction of recombinant bacillus Calmette-Gu 茅 rinn rBCG by expressing some important protective antigen coding genes is one of the important methods to improve the efficacy of TB vaccine. In general, the constructed rBCG secretes the antigen to the extracellular surface or anchors it on the surface of the extracellular membrane, which is more effective in presenting and producing the immune response. Objective: to compare the activity of pfurAma-N, pfurAma-N3 and phsp60 controlling gene expression in the mutant pfurAma of Mycobacterium tuberculosis, and to construct the membrane anchored expression vector of Mycobacterium tuberculosis. The expression of exogenous target protein and its subcellular localization were analyzed. Methods the promoter pfurAma mutants were amplified by 1: -PCR, and the additional Nde 鈪，

本文編號(hào)：1863731