發(fā)布時(shí)間：2018-05-08 17:29

  本文選題：肺炎鏈球菌 + ZmpB��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的 肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae, S.pn)作為最重要的人類病原菌之一能夠引起危及生命的侵襲性疾病,尤其是在老人和小孩中。其造成的死亡在美國及歐洲是所有能夠用疫苗預(yù)防疾病中最高的,而在世界范圍內(nèi)絕大多數(shù)的死亡是發(fā)生在發(fā)展中國家。由于耐藥問題的愈發(fā)嚴(yán)重,疫苗已經(jīng)成為防治S.pn的重點(diǎn)。 鋅金屬蛋白酶(Zinc metalloprotease B, ZmpB)存在于所有分離出的肺炎鏈球菌中[15],其作為一個(gè)毒力因子能夠誘導(dǎo)下呼吸道腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生。用基因展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZmpB的抗原位點(diǎn)能夠與77%的成人血清反應(yīng),高于PspA的60%。這些結(jié)果提示ZmpB可能是肺炎鏈球菌一個(gè)良好的新疫苗靶點(diǎn)。肺炎鏈球菌DnaJ(HSP40)作為熱休克蛋白之一,具有高度的保守性,用粘膜以及腹腔免疫后均能夠抵御多種肺炎鏈球菌的攻擊。肺炎鏈球菌溶血素(Ply)是近年來廣泛研究的候選疫苗蛋白,其無溶血活性突變體ΔA146 Ply能針對(duì)肺炎鏈球菌感染產(chǎn)生良好的保護(hù)作用。 本文擬在評(píng)價(jià)ZmpB作為疫苗候選蛋白的潛力的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究其與DnaJ、Ply聯(lián)合后的保護(hù)效果。 方法 在大腸桿菌中進(jìn)行克隆和表達(dá)ZmpB重組蛋白(保守區(qū)段),免疫BALB/C小鼠得到抗ZmpB的多克隆抗體。通過Western blot鑒定ZmpB在不同肺炎鏈球菌菌株中的表達(dá)情況;評(píng)價(jià)ZmpB蛋白以及抗ZmpB多抗對(duì)于S.pn介導(dǎo)的A549細(xì)胞粘附的影響;ELISA方法檢測(cè)免疫后血清中的抗體亞型以及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子分泌情況。對(duì)ZmpB、DnaJ、ΔA146 Ply單個(gè)蛋白粘膜免疫后小鼠用不同菌株進(jìn)行定植實(shí)驗(yàn)以及生存率的評(píng)價(jià)。并對(duì)ZmpB、DnaJ、ΔA146 Ply單一或聯(lián)合通過腹腔途徑免疫小鼠,通過鼻腔和腹腔兩種攻毒方式分別評(píng)價(jià)其抵擋S.pn定植和抵抗S.pn引起敗血癥感染的能力,并利用各組特異性的抗血清進(jìn)行被動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)。 結(jié)果 本研究成功表達(dá)了包含成熟ZmpB蛋白15到590氨基酸的多肽,其純度90%。Western Blot鑒定發(fā)現(xiàn)抗ZmpB多克隆抗體能夠與2型,3型,6B,14以及19F型的肺炎鏈球菌裂解物反應(yīng),其反應(yīng)區(qū)帶大約在210Kda(ZmpB全長(zhǎng)蛋白分子量)處。無論是ZmpB的重組蛋白還是抗ZmpB的多抗都能夠有效抑制肺炎鏈球菌與A549細(xì)胞的粘附作用。粘膜免疫ZmpB后能夠刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-10、IFN-γ和IL-17A,并刺激小鼠產(chǎn)生以IgG1為主抗體亞型;并能夠顯著降低19F以及14型肺炎鏈球菌在肺部的定植,提高2型,3型,6B以及14型菌攻毒后小鼠的生存時(shí)間。用重組ZmpB與DnaJ和ΔA146 Ply進(jìn)行聯(lián)合的腹腔免疫,與單個(gè)蛋白免疫相比能夠顯著提高對(duì)肺炎鏈球菌感染的保護(hù)力(p0.05);被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)同樣證明了用這三種蛋白聯(lián)合免疫后得到的高免疫狀態(tài)的抗血清得到的保護(hù)效果好于單個(gè)抗血清(p0.05)。 結(jié)論 ZmpB在5種血清型肺炎鏈球菌株中均有表達(dá),腹腔和粘膜免疫重組ZmpB均能夠抵抗多種肺炎鏈球菌的感染。因此, ZmpB是一個(gè)肺炎鏈球菌蛋白疫苗的良好候選抗原。ZmpB與DnaJ、Ply聯(lián)合使用后能夠產(chǎn)生一定的協(xié)同作用,使保護(hù)效果顯著提高。
[Abstract]:Purpose


Streptococcus pneumoniae ( S . pn ) , one of the most important human pathogens , can cause life - threatening attacks , especially in the elderly and children . The deaths caused by the disease are the highest among all vaccine - preventable diseases in the United States and Europe , and the vast majority of deaths in the world are occurring in developing countries . The vaccine has become the focus of the control of S.pn because of the growing number of drug - resistant problems .


Zinc metalloproteases ( ZmpB ) are present in all isolated strains of Streptococcus pneumoniae , which act as a virulence factor to induce the production of lower respiratory tract tumor necrosis factor alpha ( TNF - 偽 ) . The results suggest that ZmpB can be a good new vaccine target for Streptococcus pneumoniae . These results suggest that ZmpB may be a good new vaccine target for Streptococcus pneumoniae .


Based on the evaluation of the potential of ZmpB as vaccine candidate protein , this paper further studies the protective effect of ZmpB combined with DnaJ and Ply .


method


ZmpB , DnaJ and 螖A146 Ply were used to evaluate the effects of ZmpB , DnaJ and 螖A146 Ply on the adhesion of S . pn - mediated A549 cells .


Results


Western Blot identification showed that anti - ZmpB polyclonal antibody was able to react with 2 - , 3 - , 6B - , 14 - and F - type Streptococcus pneumoniae lysate .


Conclusion


ZmpB is a good candidate for S . pneumoniae protein vaccine . ZmpB is a good candidate for S . pneumoniae protein vaccine . ZmpB is a good candidate for Streptococcus pneumoniae protein vaccine .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1862332