本文選題：昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng) + 重組MICA蛋白��； 參考：《蘇州大學》2012年博士論文

【摘要】：腎移植后隨著新型針對T細胞強效免疫抑制劑的廣泛聯(lián)合應用，使急性細胞性排斥反應得到了很好的控制，也大大減少了早期移植腎的丟失。然而，近年研究表明移植腎長期存活并沒有隨之得到很好改善，這使人們開始重視HLA（Human leukocyteantigen，HLA）抗體介導的急、慢性體液性排斥反應對移植腎長期存活的意義。盡管在抗體介導排斥反應中，多數(shù)情況是由于HLA抗體的緣故，但在一些HLA抗體陰性的患者中也發(fā)生了腎移植失功，這表明除HLA抗體外還存在其它抗體也介導移植腎失功。 主要組織相容性復合物-Ⅰ類相關(guān)鏈A（Major histocompatibility complex classI related chain A，MICA）基因位于人第6號染色體的MHC-I類區(qū)域中，具有高度多態(tài)性，其編碼MICA分子表達在內(nèi)皮細胞表面。功能上MICA分子不結(jié)合β2微球蛋白，缺乏與CD8受體特定結(jié)合的殘基，沒有抗原肽遞呈能力；其系通過與NKG2D（Naturalkilling cells receptor G2D，NKG2D）受體結(jié)合實現(xiàn)生物學功能。NKG2D是為NK細胞活化性受體，除表達于NK細胞外，還表達在γδT、CD8+T細胞上。MICA分子與NKG2D結(jié)合后不僅能激活NK細胞和T細胞毒性作用，分泌大量細胞因子及細胞毒介質(zhì)，造成移植物破壞；而且能促使B細胞產(chǎn)生相應MICA抗體，參與體液免疫應答。 由于MICA分子通常不表達在淋巴細胞表面，在腎移植時通常采用的淋巴細胞交叉反應無法檢測到MICA抗體。近年隨著MICA抗體檢測技術(shù)的進步，，多個器官移植中心在移植受者、排斥反應前、發(fā)生排斥反應切除的移植物中及其洗脫液中都檢測到MICA抗體，使MICA抗體的體液免疫作用備受關(guān)注，成為移植免疫研究的熱點。一系列研究表明，MICA抗體與排斥反應相關(guān)，對移植物的長期存活存在負面效應，這種負面效應在HLA良好配型無或少量HLA抗體的受體中更為明顯。雖然有研究認為MICA抗體可以通過補體依賴的細胞毒途徑造成內(nèi)皮細胞損傷，引起移植物失功；但對MICA抗體引起急、慢性排斥反應的確切分子免疫作用機制及系統(tǒng)干預措施目前仍不十分清楚，也缺乏特異性MICA抗體介導的體液性排斥反應動物模型相關(guān)方面研究。 因此，我們設想采用蛋白重組技術(shù)制備具有免疫活性的重組MICA08蛋白免疫大鼠，建立預存特異性MICA抗體動物模型。通過對預存特異性MICA抗體動物進行腎移植誘導建立特異性MICA抗體介導的排斥反應并觀察其對大鼠移植腎的影響，探討新型免疫劑利妥昔單抗在干預MICA抗體介導的排斥反應中的價值。研究分三個部分： 第一部分：應用昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)制備重組MICA08蛋白 目的：應用昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲細胞(Sf-9)中表達人MICA008胞外結(jié)構(gòu)域。 方法：采用昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-MICA008，并將其轉(zhuǎn)化到E. coliDH10Bac感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)座，通過藍白斑篩選和測序鑒定后，獲得重組桿狀病毒Bacmid-MICA008；應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Sf9細胞進行目的蛋白表達，并對表達產(chǎn)物進行鎳柱親和層析純化、Western blot和考馬斯亮蘭染色鑒定。結(jié)果：在重組病毒感染第四天后收集P3代病毒上清液，P3代上清液經(jīng)鎳柱親和層析純化，最后獲得純化重組MICA08蛋白量約為1.4-1.5mg/L。純化MICA08蛋白經(jīng)Westernblot和考馬斯亮藍染色鑒定，可見一條分子量約為37kDa的特異性條帶與目的蛋白大小相符。 結(jié)論：應用昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)可在昆蟲細胞中成功表達重組人MICA08蛋白，為下步預存抗體模型的建立奠定了物質(zhì)基礎。 第二部分顯微外科微血管吻合技能訓練及大鼠原位腎移植模型建立目的：探討快速建立大鼠原位腎移植模型的顯微外科訓練方法，為開展腎移植基礎研究奠定基礎。 方法：設計并實施循序漸進式顯微外科訓練項目，以快速突破微血管吻合技術(shù)瓶頸。訓練項目包括鏡下紗布縫合、大鼠頸動脈吻合、大鼠股血管吻合及大鼠尾動脈吻合訓練。然后采用30例同系SD大鼠供體雙腎切除原位移植訓練積累手術(shù)經(jīng)驗，克服學習曲線；術(shù)中腎血管重建采用端-端吻合法，尿路重建運用膀胱瓣技術(shù)或輸尿管-輸尿管端端吻合。模型穩(wěn)定后，再行20例SD→Wistar大鼠異系移植建立急性排斥反應模型，并將其隨機分排斥組和MMF治療組，MMF治療組給予MMF20mg/kg/d灌胃，×10d。在術(shù)后第3d、7d、14d、21d采血，行血清肌酐檢測。結(jié)果：通過2個月強化顯微外科培訓，完成了200根以上微血管吻合練習，大鼠腎移植模型趨于穩(wěn)定，術(shù)后一周成活率達90%。在行20例異系移植中，平均手術(shù)時間為72.9±4.18min，平均熱缺血時間為25.4±1.63min。排斥組大鼠BCr在術(shù)后第三天開始升高，而MMF組在術(shù)后14天開始升高；兩組分別于術(shù)后第7天和術(shù)后21天達頂峰，與同系組相比差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P 0.05）。 結(jié)論：規(guī)范化化顯微外科培訓可短期獲得顯微外科微血管吻合技能，縮短大鼠腎移植手術(shù)學習曲線。對SD→Wistar大鼠進行腎移植，可建立穩(wěn)定、可靠的急性排斥反應模型。 第三部分：預存特異性MICA抗體動物模型的建立及其抗體對大鼠移植腎的影響 目的：建立預存特異性MICA抗體動物模型，探討預存特異性MICA抗體對大鼠移植腎的影響及其干預措施。 方法：采用重組MICA08蛋白和P3代Sf-9細胞免疫大鼠，建立預存特異性MICA抗體動物模型。對預存特異性MICA抗體的大鼠進行腎移植誘導MICA抗體體液免疫，并采用MMF和利妥昔單抗進行干預。從血清抗體、肌酐及腎臟病理等角度分析預存MICA抗體對大鼠移植腎的影響和利妥昔單抗在抗體介導的體液排斥反應中的干預作用。 結(jié)果：在重組MICA08蛋白致敏的動物中，術(shù)前特異性MICA抗體分值為2分，術(shù)后特異性MICA抗體滴度升高達6分，與術(shù)前相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在P3代Sf-9細胞致敏的動物中，術(shù)前特異性MICA抗體為6分，術(shù)后MICA抗體滴度升高達8分，與術(shù)前相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在利妥昔單抗干預組中，淋巴細胞CD20表型較術(shù)前明顯減低，與術(shù)前、對照組和實驗組相比均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明利妥昔單抗對CD20表型的淋巴細胞具有很好清除作用。與MMF實驗組相比，利妥昔單抗抑制術(shù)后特異性MICA抗體滴度升高效果不明顯。在采用MMF為基礎免疫抑制劑治療中，術(shù)后第14d預存MICA抗體組與普通對照組相比腎功能要差，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示預存MICA抗體對移植腎具有負面影響；在預存抗體組中，MMF聯(lián)合利妥昔單抗的干預組在術(shù)后第14天腎功能優(yōu)于MMF單獨用藥的實驗組，提示利妥昔單抗在干預體液性排斥中可能具有潛在價值。 結(jié)論：采用純化重組MICA08蛋白和P3代Sf-9細胞免疫動物可以建立預存特異性MICA抗體動物模型。對預存特異性MICA抗體的大鼠進行腎移植術(shù)后可以誘導MICA抗體滴度升高。利妥昔單抗在干預特異性MICA抗體介導的排斥反應中具有潛在價值。
[Abstract]:However , in recent years , it has been shown that the long - term survival of transplanted kidney has not been improved . However , in recent years , it has been shown that the long - term survival of transplanted kidney has not been well improved .
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本文編號：1856854