發(fā)布時(shí)間：2018-05-07 11:17

  本文選題：神經(jīng)干細(xì)胞 + S蛋白酶體β亞單位　； 參考：《神經(jīng)解剖學(xué)雜志》2017年05期

【摘要】：目的:優(yōu)化20S蛋白酶體β5亞單位(proteasome subunit beta type-5,PSMB5)-shRNA慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的方案,觀察PSMB5表達(dá)下調(diào)對NSCs增殖和分化能力的影響,探討調(diào)控NSCs潛能的分子機(jī)制。方法:構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的PSMB5-shRNA慢病毒載體,并設(shè)錯(cuò)義序列對照,感染新生小鼠(postnatal day 0,P0)NSCs。倒置熒光顯微鏡觀察GFP陽性率,計(jì)算感染率,RT-PCR、免疫印跡和熒光分光光度法檢測PSMB5沉默效率和蛋白酶體活性。比較對照組和shRNA組神經(jīng)球的數(shù)量和直徑,利用CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察PSMB5基因沉默對NSCs增殖潛能的影響。Tuj1染色觀察PSMB5基因沉默對NSCs分化能力的影響。結(jié)果:PSMB5-shRNA慢病毒感染NSCs 24 h后可見GFP熒光表達(dá),48 h達(dá)峰值,傳代后可見GFP穩(wěn)定表達(dá)。其感染復(fù)數(shù)MOI為40,polybrene 3μg/ml時(shí),感染48 h GFP陽性率可達(dá)92.5%±2.3%;PSMB5-shRNA組PSMB5 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別較對照組降低66.49%±4.81%(P0.001)和33.1%±2.54%(P0.001)。PSMB5-shRNA組蛋白酶體活性較對照組下降43.4%±1.48%(P0.01)。shRNA組NSCs的增殖能力降低,神經(jīng)球數(shù)量為126.5±8.4顯著低于對照組163.5±9.5(P0.01),神經(jīng)球的平均直徑為29.9μm±2.6μm顯著低于對照組42.9μm±2.3μm(P0.01)。CCK-8結(jié)果表明PSMB5-shRNA組細(xì)胞吸光度值0.36±0.04,顯著低于對照組0.59±0.03(P0.001),PSMB5-shRNA組Tuj1+陽性率為39.13%±8.14%,較對照組顯著降低(P0.01)。結(jié)論:PSMB5基因沉默可降低NSCs蛋白酶體活性抑制P0期小鼠NSCs增殖分化能力。
[Abstract]:Aim: to optimize the protocol of proteasome subunit beta type-5 PSMB5-shRNA lentivirus infected neural stem cells (NSCS), observe the effect of down-regulation of PSMB5 expression on the proliferation and differentiation of NSCs, and explore the molecular mechanism of regulating NSCs potential. Methods: the PSMB5-shRNA lentivirus vector carrying the green fluorescent protein (GFP) gene was constructed, and the missense sequence control was used to infect the newborn mice with postnatal day 0 (P0). The positive rate of GFP was observed by inverted fluorescence microscope, the infection rate was calculated by RT-PCR, the silencing efficiency and proteasome activity of PSMB5 were detected by Western blot and fluorescence spectrophotometry. The number and diameter of neurospheres in control group and shRNA group were compared. The effect of PSMB5 gene silencing on the proliferative potential of NSCs was observed by CCK-8 assay. The effect of PSMB5 gene silencing on the differentiation of NSCs was observed by staining. Results the fluorescence expression of GFP reached its peak at 48 h after infection with NSCs and stable expression of GFP was observed after passage. The expression of PSMB5 mRNA and protein in PSMB5-shRNA group decreased by 66.49% 鹵4.81% (P 0.001) and 33.1% 鹵2.54%(P0.001).PSMB5-shRNA (43.4% 鹵1.48%(P0.01).shRNA), respectively, when the complex MOI was 40 渭 g/ml. The positive rate of GFP was 92.5% 鹵2.3%. The expression of PSMB5 mRNA and protein in PSMB5-shRNA group was lower than that in control group (66.49% 鹵4.81%, P 0.001) and 33.1% 鹵2.54%(P0.001).PSMB5-shRNA group (43.4% 鹵1.48%(P0.01).shRNA group, respectively). The number of nerve balls was 126.5 鹵8.4 significantly lower than that of the control group (163.5 鹵9.5) P0.01G, and the average diameter of the neurosphere was 29.9 渭 m 鹵2.6 渭 m significantly lower than that of the control group (42.9 渭 m 鹵2.3 渭 m(P0.01).CCK-8). The results showed that the cell absorbance of the PSMB5-shRNA group was 0.36 鹵0.04, and the positive rate of Tuj1 was 39.13% 鹵8.14B in the PSMB5-shRNA group, which was significantly lower than that in the control group. Conclusion the silencing of PSMB5 gene can decrease the activity of NSCs proteasome and inhibit the proliferation and differentiation of NSCs in P0 phase mice.
【作者單位】： 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院;山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室;
【基金】：國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510114005) 山西省自然科學(xué)基金(2015011132) 山西省歸國留學(xué)人員基金項(xiàng)目(2014-033)
【分類號】：R329.2

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本文編號：1856709