本文選題：NOR1基因 + 缺氧　； 參考：《中南大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：[NOR1基因的克隆及前期研究基礎(chǔ)] 通過(guò)抑制性消減雜交和cDNA微陣列技術(shù),發(fā)現(xiàn)NOR1的EST W95442在正常鼻咽上皮與鼻咽癌組織中存在表達(dá)差異。借助于生物信息學(xué),采用EST介導(dǎo)的cDNA克隆方法,得到了EST W95442相應(yīng)的NOR1全長(zhǎng)cDNA序列。將NOR1轉(zhuǎn)入鼻咽癌細(xì)胞HNE1后可以抑制HNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。在25例鼻咽癌及4例正常鼻咽上皮組織中發(fā)現(xiàn)NOR1的1號(hào)外顯子區(qū)存在一個(gè)非同義的編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(coding Single nucleotide polymorphism, cSNP)(Glu58Gly)。多組織膜Northern-blot分析表明,NOR1在人的骨骼肌表達(dá)最高,其次是心、腦、腎、肺。這些組織都是機(jī)體代謝功能、細(xì)胞呼吸較為旺盛部位。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)NOR1含一個(gè)Nitro-oxidored domain,編碼一種潛在的氧化還原酶,主要定位在胞漿,少量位于線粒體,提示NOR1的功能可能與細(xì)胞有氧呼吸和／或細(xì)胞的代謝密切相關(guān)。 [NOR1在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào),且在缺氧誘導(dǎo)下表達(dá)升高] 前期原位雜交的研究結(jié)果表明,NOR1的表達(dá)差異僅在腫瘤與非腫瘤組織之間,并且這種差異與腫瘤的臨床病理組織類型和腫瘤的轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān),提示NOR1的下調(diào)是腫瘤發(fā)生的早期事件。利用CLONTECH公司的cancer profiling array(包含19種腫瘤組織以及相應(yīng)的癌旁組織)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：NOR1在肝癌、胰腺癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、外陰上皮癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌、皮膚癌的腫瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào),說(shuō)明NOR1的表達(dá)下調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。 本研究以及前期研究所檢測(cè)的腫瘤均為實(shí)體瘤,而缺氧是實(shí)體腫瘤發(fā)生早期的共同事件。作為具有潛在氧化還原酶功能的NOR1,其表達(dá)是否會(huì)因細(xì)胞氧化還原環(huán)境的改變(如：缺氧等刺激)而改變?令人驚奇的是,利用缺氧、氯化鈷(CoCl2)以及H2O2分別對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)NOR1的表達(dá)均明顯上調(diào),并且處理后的HeLa細(xì)胞周期阻滯在S、G2期(其中缺氧誘導(dǎo)是S期,CoCl2誘導(dǎo)是S、G2期而H2O2則只是G2期)。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induced factor, HIF-1α)是通過(guò)缺氧應(yīng)激啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄因子,NOR1的上調(diào)可能受HIF-1的調(diào)節(jié)。經(jīng)antisense-HIF-1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞并通過(guò)CoCl2誘導(dǎo),NORl的表達(dá)并未隨HIF-1表達(dá)下調(diào)而下降,提示NOR1的表達(dá)與HIF-1無(wú)明顯相關(guān)。 檢測(cè)腫瘤組織的NOR1表達(dá)為下調(diào),而體外的缺氧誘導(dǎo)卻使NOR1表達(dá)升高,出現(xiàn)這種矛盾是因何原因? [NOR1的表達(dá)抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡] NOR1的表達(dá)明顯抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞軟瓊脂集落形成。通過(guò)生長(zhǎng)曲線結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察轉(zhuǎn)染空白載體及NOR1的HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,結(jié)果顯示NOR1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯著低于轉(zhuǎn)染空白載體的細(xì)胞,同時(shí)形成的細(xì)胞集落明顯較少,并且集落的體積也明顯變小。NORl使HeLa細(xì)胞在增殖過(guò)程中DNA的復(fù)制受抑而阻滯于S期,并且增加細(xì)胞的凋亡。將NOR1的反義互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞,通過(guò)透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的核／漿比值增加的比例較對(duì)照細(xì)胞明顯增多。從上述結(jié)果說(shuō)明,NOR1可以通過(guò)周期抑制和細(xì)胞凋亡來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng),而在非腫瘤細(xì)胞中減少NOR1的表達(dá)可以增加細(xì)胞的惡性表型。 [NOR1與細(xì)胞的代謝] 將轉(zhuǎn)染空白載體及NOR1的HeLa細(xì)胞的總RNA與缺氧信號(hào)通路微陣列(Oligo GEArray(?) Human Hypoxia Signaling Pathway Microarray:主要包含與缺氧應(yīng)激相關(guān)的基因：應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因、氧化還原酶類、缺氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子以及輔因子、凋亡相關(guān)基因、缺氧相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因等)雜交發(fā)現(xiàn),NORl的表達(dá)使HeLa細(xì)胞內(nèi)大部分與缺氧相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào),唯一的上調(diào)基因是Bax, Bax參與凋亡的正向調(diào)節(jié)。在表達(dá)下調(diào)的基因中挑選己糖激酶基因(hexokinase, HK2)、過(guò)氧物酶體增殖激活受體α (peroxisome proliferative activated receptor a, PPARA)以及缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑(factor inhibit HIF1, FIH-1),通過(guò)適時(shí)定量PCR驗(yàn)證與微陣列的結(jié)果一致。HK2是糖酵解反應(yīng)的第一個(gè)限速酶,它的下調(diào)意味著糖酵解過(guò)程受抑,而糖酵解功能減弱可以增加抗癌藥物的療效。PPARA調(diào)節(jié)脂肪酸代謝且與腫瘤的發(fā)生相關(guān),微陣列結(jié)果示PPARA所調(diào)節(jié)的下游基因：血管形成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein4, ANGPTL4)和溶血磷脂酸�；D(zhuǎn)移酶2(1-acyl-sn-glycerol3-phosphate acyltransferase2, AGPAT2)均下調(diào),它們分別參與降糖、升脂以及甘油三脂合成代謝功能,同時(shí)兩個(gè)基因編碼的蛋白活性下降均可以誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。FIH-1(又名HIFIAN)是一個(gè)Fe(Ⅱ)、2-氧戊二酸依賴的加雙氧酶,可以羥化HIF-1轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域中的Asp803使其轉(zhuǎn)錄活性下降而備受關(guān)注,NOR1明顯下調(diào)FIH-1的表達(dá),提示可能增加HIF-1的轉(zhuǎn)錄功能,但微陣列結(jié)果所示受HIF-1調(diào)節(jié)的下游基因表達(dá)并無(wú)改變,說(shuō)明NOR1可能調(diào)節(jié)FIH-1作為氧化還原酶所參與的其他功能。 [NOR1通過(guò)p53及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與細(xì)胞凋亡] 在缺氧誘導(dǎo)的凋亡中,p53起著非常重要的作用,而且p53通過(guò)抑制DNA的合成使細(xì)胞周期阻滯于S期。NOR1的表達(dá)使p53的表達(dá)上調(diào),同時(shí)HeLa細(xì)胞的凋亡比例以及被阻滯在S期的細(xì)胞明顯增加,說(shuō)明由NOR1引起的凋亡中,p53同樣有著舉足輕重的作用。將綠色熒光標(biāo)記的NOR1轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞,用CoCl2、HA分別誘導(dǎo)后,發(fā)現(xiàn)兩種誘導(dǎo)都使NOR1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上大量聚集,并出現(xiàn)在腫脹的線粒體內(nèi)。同時(shí)分別檢測(cè)胞漿、線粒體的cytochrome C和caspase9的表達(dá),兩個(gè)分子均由線粒體移至胞漿。微陣列結(jié)果顯示,Bax表達(dá)上調(diào),BcL-2卻表達(dá)下調(diào)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體在細(xì)胞的凋亡過(guò)程中,都是非常重要的細(xì)胞器,許多調(diào)節(jié)和效應(yīng)分子如：Ca2+、Bax、BcL-2等將兩者在細(xì)胞凋亡事件中緊密聯(lián)系在一起。研究者推測(cè),NOR1引起的凋亡可能首先由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)啟動(dòng)凋亡,導(dǎo)致大量Ca2+的釋放,激活BcL-2家族成員Bax,同時(shí)BcL-2表達(dá)下降增加Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的釋放,線粒體攝取后引起線粒體膜勢(shì)能下降,導(dǎo)致線粒體腫脹同時(shí)釋放cytochrome C和caspase9并激活caspase3等一系列凋亡效應(yīng)分子,將凋亡的信號(hào)放大,最終使凋亡的HeLa細(xì)胞增加。 通過(guò)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示體外實(shí)驗(yàn)時(shí),NOR1能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),促進(jìn)凋亡,同時(shí)NOR1的過(guò)表達(dá)對(duì)抗糖酵解反應(yīng)并影響脂肪代謝,而體內(nèi)的缺氧的腫瘤細(xì)胞則抑制凋亡并通過(guò)糖酵解反應(yīng)以及脂肪代謝穩(wěn)定能量供應(yīng)來(lái)適應(yīng)缺氧的刺激,這可能部分解釋前述的同在缺氧環(huán)境中,NOR1體內(nèi)、體外的表達(dá)矛盾。通過(guò)進(jìn)一步的研究揭示NOR1的功能可能為腫瘤的發(fā)生以及治療提供新的內(nèi)容。
[Abstract]:Cloning and Preliminary Study of Gene Cloning and Preliminary Study of Genomic DNA

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本文編號(hào)：1854340